表达延边饲养鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物对鹅细小病毒活性影响的初步研究

摘要

干扰素(Interferon，IFN)是由机体细胞产生的一类具有抗肿瘤、抗病毒、调节免疫功能等多种生物活性的糖蛋白，是机体防御系统的重要组成部分。在众多干扰素类型中，a干扰素具有广谱的抗病毒活性和良好的免疫调节作用，能够增强机体的免疫力。
　　为了开展延边饲养鹅α干扰素基因及其重组载体疫苗的研究，本试验应用植物血凝素（PHA）刺激延边饲养鹅外周血单核细胞，提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增编码鹅α干扰素的基因，将目的基因经 TA克隆后进行序列测定分析，将测序正确的经双酶切，构建重组原核表达质粒 pET-30a-IFN-α，并在大肠杆菌 BL21（DE3）中获得表达，对表达融合蛋白进行 SDS-PAGE和 Western-blot分析鉴定，将蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠，制备鼠抗延边饲养鹅a干扰素成熟蛋白多克隆抗体，通过琼脂糖扩散试验经行效价检测。结果表明，扩增的鹅α干扰素基因全长576 bp，编码192个氨基酸；成功构建了重组原核表达载体pET-30a-IFN-α，表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot检测，分子质量大小约为29 ku，并具有良好的反应原性；成功制备鼠抗鹅 a干扰素成熟蛋白多克隆抗体，琼脂糖扩散试验检测效价为1:32。
　　为了研究表达延边饲养鹅α干扰素基因重组活载体疫苗的抗病毒活性，本试验通过RT-PCR技术扩增得到延边饲养鹅α干扰素基因，利用基因重组技术构建了pSY681-LP2EP2- IFN-α-Lac转移载体,采用脂质体转染方法将该重组质粒与禽痘病毒 FPV-017共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），进行蓝白斑筛选，收获纯化的重组病毒，并进行重组病毒α干扰素基因的PCR鉴定及重组病毒的间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测，通过细胞病变分析干扰素的抗病毒活性。结果显示，成功制备了重组禽痘病毒rFPV-IFN-α，PCR结果显示成功将延边饲养鹅α干扰素基因亚克隆到禽痘病毒载体，间接免疫荧光和Western blot检测表明延边饲养鹅α干扰素基因在 CEF中成功获得表达，且具有良好的反应原性；表达产物α干扰素对鹅细小病毒（GPV）在鹅胚成纤维细胞中的复制具有抑制作用。
　　本研究为进一步开展延边饲养鹅α干扰素基因重组活载体疫苗的体内试验和鹅α干扰素免疫调节作用奠定了基础。

目录

声明

前言

1 概述

2 干扰素的分类及产生

3 α干扰素的结构特征及一般特性

4 α干扰素受体

5 α干扰素的生物学活性

6 禽类α干扰素的研究进展

7 禽痘病毒载体及其应用

8 本试验的立题依据、目的和意义

材料与方法

1 试验材料

2 试验方法

结果

1延边饲养鹅α干扰素基因RT-PCR扩增及克隆质粒鉴定

2 延边饲养鹅α干扰素基因序列测定及分析

3 重组表达质粒pET-30a-IFN-α鉴定

4 重组质粒诱导表达

5 重组蛋白存在形式鉴定

6 重组蛋白纯化

7重组蛋白Western blot分析

8多克隆抗体效价测定

9 延边饲养鹅IFN-α基因RT-PCR扩增及克隆质粒鉴定

10 pSY538-IFN-α 重组质粒构建

11 pSY681-LP2EP2-IFN-α重组质粒构建

12 pSY681-LP2EP2-IFN-α-Lac Z重组质粒构建

13 重组禽痘病毒的获得

14 重组禽痘病毒α干扰素基因PCR鉴定

15 重组病毒的Western-blot鉴定和间接免疫荧光鉴定结果

16 抗病毒活性检测

讨论

总结

参考文献

致谢

作者简介