重组人血管内皮抑素治疗恶性浆膜腔积液的基础与临床应用研究

摘要

目的：观察、探究重组人血管内皮抑素（rh-Endostatin，商品名称：恩度，英文名称：Endostar，研发代号：YH-16）治疗恶性浆膜腔积液的作用机制，评价Endostar浆膜腔内灌注治疗恶性浆膜腔积液的临床疗效和应用安全性。
　　方法：本实验研究选择 BALB/C小鼠，采用 H22肝癌腹水瘤细胞株腹腔内注射建立H22腹水瘤实验模型。
　　（1）Endostar对荷H22腹水瘤小鼠作用的实验 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠作用的实验动物分组：180只小鼠随机分为6组，每组30只，Ⅰ组：阴性对照组（0.9％氯化钠，0.2ml）；Ⅱ组：阳性对照组（顺铂1mg/kg）；Ⅲ组：低剂量治疗组（Endostar5mg/kg）；Ⅳ组：中剂量治疗组（Endostar10mg/kg）；Ⅴ组:高剂量治疗组（Endostar15mg/kg）；Ⅵ组:联合治疗组（顺铂1mg/kg+中剂量Endostar10mg/kg）。腹腔内隔日注射用药，共3次，每次给药前处死6只。观察小鼠一般情况，记录小鼠体重变化，存活状况，计算存活率，绘制生存曲线，收集腹水及血液，酶联免疫吸附法（ELISA）检测血管内皮生长因子（VEGF）的浓度。
　　（2）Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管形态研究60只小鼠分6组，每组10只。分组同实验（1）。小鼠腹腔积液长出后经超声检查确认，各组均隔日腹腔药物注射，调整药物浓度，总共给药3次。停药1天后处死小鼠。腹膜标本光镜HE染色，观察腹膜血管及细胞形态学变化。比较生理盐水、顺铂及中剂量Endostar组腹膜微血管密度。电镜观察腹膜形态学变化。
　　（3）Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子检测40只小鼠分2组，中剂量连续给药组（连续组）和中剂量隔2日给药组（隔2日组）各20只；实验采用中剂量组10.00mg/kg给药，连续组d7，d8，d9，d10，d11，d12给药，隔2日组分别于d7，d10给药。均在d7，d13处死小鼠各10只。采用ELISA法和SP法分别检测腹水、腹膜组织中VEGF、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、存活素（Survivin）、Caspase-3、Caspase-9、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2）和Bcl-xl的表达。
　　（4）Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管机制研究78只小鼠共分为4组，中剂量给药，连续组（2a）：d7，d8，d9，d10，d11，d12；隔日组（2b）：d7，d9，d11；隔2日组（2c）：d7，d10；每周组（2d）：d7；连续组、隔日组分别于d7，d9，d11，d13处死小鼠每组6只，隔2日组于d7，d10，d13；每周组于d7，d13处死小鼠。对实验腹膜组织分别进行Real-Time PCR检测MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA，蛋白印迹法（Western blot）检测腹膜蛋白表达水平。
　　（5）Endostar对恶性浆膜腔积液患者的区域灌注治疗的临床观察晚期恶性肿瘤合并浆膜腔积液的患者共60例，随机分组，分为Endostar腔内单药灌注治疗组（单药组）31例，Endostar与顺铂联合局部灌注治疗组（联合组）29例。超声定位，“猪尾巴”导管积液腔内穿刺导管留置术，尽可能放尽积液，单药组由导管注入Endostar行局部区域灌注治疗。胸腔积液或心包腔积液患者，Endostar单次注入30mg；腹腔积液患者，Endostar单次注入45mg，隔日1次，连续使用1-2周时间，视积液情况，每周1～2次维持。联合治疗组在单药基础上联合加用顺铂化疗（联合组），顺铂剂量30～40mg/m2。RECIST1.1“不可测量病灶”疗效评价标准，计算临床获益率（DCR），评价生活质量（QOL）以及NCI CTC3.0版标准评价毒副反应。
　　结果：
　　（1）Endostar对荷H22腹水瘤小鼠作用荷H22腹水瘤小鼠腹水出现前（第1-6天），小鼠进食、饮水、活动以及排便等一般情况均良好；接种后约第6-7天开始，生理盐水阴性对照组小鼠体重迅速增加；第9-10天开始，荷瘤小鼠逐渐出现精神萎靡、呆滞少动，活动迟缓、反应性差、食欲降低、粪便干燥等，腹水增长速度高于各用药组；第11-12天开始，小鼠晚期呆滞少动，腹部极度膨隆，呈恶液质状态；第12天对照组小鼠全部死亡；Endostar与顺铂联合组体重增加较慢，精神较好，中位生存期为17天。Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹水的抑制作用显示：实验第9天，Endostar各剂量组及Ⅱ组较Ⅰ组出现的腹水量减少，荷瘤小鼠体重差异有统计学意义，但是Endostar各剂量组较Ⅱ组无统计学差异；第11天，Endostar各剂量组较Ⅰ组、Ⅱ组荷瘤小鼠有统计学意义；Endostar各剂量组间比较Ⅳ组较Ⅲ、Ⅴ组荷瘤小鼠体重差异有统计学意义；第13天，各组荷瘤小鼠的体重均发生了显著的变化，组间比较均有统计学意义；第9天、第11天、第13天Ⅵ组较Ⅰ组出现的腹水量少，荷瘤小鼠体重差异有统计学差异；较Ⅱ组有统计学差异；较Endostar各剂量组荷瘤小鼠体重差异有统计学意义。Endostar对荷H22腹水瘤小鼠生存时间的影响显示：Ⅰ组中位生存时间为10.54士0.32天，时间最短；Ⅵ组最长，为17.01士0.31天，Endostar不同剂量组荷瘤小鼠的生存时间较对照组延长，差异显著；Endostar各剂量组间比较Ⅳ组较Ⅲ组生存时间差异有统计学意义；Ⅵ组较Ⅰ组、Ⅱ组、及Endostar各剂量组生存时间延长。Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹水及血清中VEGF表达的影响：实验第9天Endostar各剂量组腹水及血清中的VEGF较Ⅰ组有统计意义；Endostar各剂量组间比较Ⅳ组腹水、血清中VEGF数值较Ⅲ、Ⅴ组差异有统计学意义；第11天各组间比较荷瘤小鼠腹水中VEGF数值下降明显，均具有统计学意义；荷瘤小鼠血清中VEGF表达，在Ⅳ组、Ⅴ组较Ⅱ组比较有统计学意义；Endostar各剂量组间比较血清VEGF数值有统计学意义；第9天、第11天Ⅵ组腹水及血清中VEGF表达较Ⅰ组、Ⅱ组、Endostar各剂量组下降均有统计学意义。
　　（2）Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管形态学的影响观察各组荷瘤小鼠腹膜和腹腔脏器表面未见有明显的种植转移瘤、转移结节形成；腹膜光镜检查各用药组腹膜血管及细胞形态未见明显差异，用药组未见大片细胞坏死及间质血管减少现象。腹膜微血管密度（MVD）检测中剂量Endostar组为13.96±0.59，与顺铂组14.24±0.40及生理盐水对照组14.36±0.57比较，其MVD绝对数值稍有降低，但无统计学差异。腹膜的电镜观察显示，生理盐水组腹膜毛细血管的通透性明显增强，毛细血管完全由单层血管内皮细胞连接而形成，细胞基底膜结构破坏，毛细血管壁极薄，细胞之间连接较疏松，并可见大量线粒体水肿、空泡化现象；3个不同剂量的Endostar组可见腹膜毛细血管壁增厚，部分趋于正常；细胞间紧密连接，缝隙连接较多；线粒体水肿明显减轻，并可见较多正常线粒体。提示Endostar可以减轻微血管损伤，使之趋于正常化。顺铂组小鼠腹膜毛细血管壁较薄，细胞基底膜损伤较重；细胞之间连接较疏松以及因小鼠生存时间延长导致线粒体出现代偿最终转化为线粒体水肿数量明显增多的现象；联合治疗组腹膜毛细血管壁明显增厚；细胞之间连接紧密以及线粒体基本正常等血管正常化改变。
　　（3）Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子检测结果荷瘤鼠恶性腹腔积液中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2等8个指标在药物干预前水平明显高于治疗后，经过Endostar干预治疗后，各指标出现明显的下降，即Endostar可以明显下调上述8个生物因子在腹腔积液中的表达水平。在治疗方式比较上，隔2日给药组腹水中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2表达水平下降的幅度更低，组间比较具有统计学意义。在对腹膜组织的组化染色比较上，也出现了与腹水ELISA检测相似的研究结果。
　　（4）Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管机制中剂量Endostar采用不同给药时间方式对荷瘤小鼠腹膜组织中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA水平检测以及蛋白表达水平的研究。Endostar采用连续给药、隔日给药、隔2给药和每周给药对荷瘤小鼠腹膜组织中MMP-2 mRNA、VEGF mRNA和Survivin mRNA的相对表达的影响显示，其相对表达明显下降，并具有统计学差异。提示Endostar可以显著的下调荷瘤鼠腹膜组织中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA表达，分析比较中剂量Endostar应用各组的抑制、下调水平，提示隔2日组给药对MMP-2 mRNA、VEGF mRNA和Survivin mRNA的相对表达量的下调作用效果最优，分别显著强于连续、每周及隔日给药组，差异显著。提示，隔2日给药组治疗效果最佳。此研究趋势在MMP-2、VEGF和Survivin蛋白表达的研究中其总体趋势相近，但Endostar连续给药组对MMP-2、VEGF和Survivin的蛋白下调效应明显优于隔日给药、隔2日以及每周给药组，具有统计学意义，提示连续给药方式具有较大的治疗优势和治疗效应；中剂量Endostar隔日、隔2日给药作用效应相近，未见组间差异，但两组的作用效应均优于每周给药治疗组，具有统计学差异。
　　（5）Endostar对恶性浆膜腔积液患者的区域灌注治疗的临床观察全组平均完成2.27个治疗周期，平均治疗持续时间为56.7天。患者治疗顺利，耐受性满意，未见有因为药物性不良反应而退出临床治疗患者。患者近期疗效：CR：10.00%，NCR/NPD：58.33%，PD：31.67%，DCR：68.33%，亚组分析，单药组合联合组各指标分别为：6.45%、54.84%、38.71%、61.29%和19.77%、62.07%、24.14%、75.86%，其联合组CR、NCR/NPD和DCR等指标绝对值均明显优于单药组，但两组间无统计学差异。全组患者治疗后QOL均有不同程度的改善，单药治疗组QOL改善者17例，占54.84%；QOL稳定者8例，占25.80%；QOL降低者6例，占19.35%。联合化疗组各指标对应为18例，占62.07%；6例，占20.69%；5例，占17.24%。组间比较未见明显差异。患者治疗中出现的Ⅲ+Ⅳ度毒副反应主要出现在联合治疗组患者中，单药组未见发生。
　　结论：
　　（1）Endostar具有抑制小鼠恶性腹腔积液的生成和延长荷瘤小鼠生存期的作用，中剂量组较其他单药剂量组显示较好的效果，Endostar和顺铂联合应用具有明显的协同作用；
　　（2）Endostar通过下调荷瘤小鼠腹腔积液中VEGF的产生和表达阻断血管生成，抑制恶性腹腔积液的形成，此效应在Endostar中剂量应用组中表现更优，并可能与顺铂联合应用具有明显的协同作用。
　　（3）Endostar具有降低荷瘤鼠腹膜微血管密度绝对值的效应，改善腹腔积液腹膜微血管超微结构的效应，降低膜血管通透性，修复细胞基底膜的损害结构，细胞间连接紧密，改善线粒体水肿、空泡化状态，引发线粒体代偿性增多，促进血管正常化。此效应在Endostar与顺铂联合给药中更加明显。
　　（4）Endostar可能通过降低腹腔积液及腹膜组织中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2等肿瘤相关因子的表达，降低血管通透性，保持基底膜完整性，诱导肿瘤细胞凋亡，改善肿瘤缺氧微环境，抑制恶性浆膜腔积液的生成。此效应与不同给药方法之间具有一定的差异。
　　（5）Endostar可以显著的降低荷瘤鼠腹膜组织中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA表达水平以及蛋白表达水平。Endostar治疗恶性浆膜腔积液的产生是一个多因素综合作用的结果。Endostar采用间断给药优于连续给药模式。
　　（6）采用Endostar浆膜腔局部灌注可以较好的改善恶性肿瘤患者浆膜腔积液的近期治疗效果，患者耐受性满意，并具有较好的临床安全性，Endostar联合化疗药物腔内灌注可能具有潜在的协同作用效果。

目录

声明

缩略词

前言

第一章 材料与方法

1.1.1 实验材料

1.1.2 实验动物

1.1.3 细胞株

1.1.4 实验仪器设备

1.1.5 实验试剂

1.2.1 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠作用研究

1.2.2 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管形态研究

1.2.3 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子检测研究

1.2.4 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管机制研究

1.2.5 临床应用观察

1.3 统计学分析

第二章 实验结果

2.1 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠作用研究

2.1.1 荷H22腹水瘤小鼠一般情况生活状况观察

2.1.2 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹水的抑制作用

2.1.3 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠生存时间的影响

2.1.4 Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹水及血清中VEGF表达的影响

2.2.1 腹膜形态学观察结果

2.2.2 腹膜光镜检查结果

2.2.3 腹膜微血管密度（MVD）结果

2.2.4 腹膜的电镜观察结果

2.3.1 腹水标本ELISA检测结果

2.3.2 腹膜组织的免疫组化检测结果

2.4.1 RNA提取

2.4.2 熔解曲线及扩增曲线

2.4.3 腹膜组织PCR检测结果

2.4.4 腹膜组织中蛋白表达检测结果

2.5 临床应用研究结果

2.5.1 临床治疗完成情况

2.5.2 临床近期疗效评价

2.5.3 生活质量评价

2.5.4 不良反应评价

第三章 讨 论

第四章 结论

参考文献

攻读博士学位期间科研情况

综述:血管内皮抑素治疗恶性肿瘤的进展

引言

一、血管内皮抑素治疗恶性肿瘤的实验研究

1.1血管内皮抑素的抗肿瘤机制

1.2血管内皮抑素的抗肿瘤特性

2.1血管内皮抑素的临床前研究

2.2重组人血管内皮抑素的临床研究

2.3重组人血管内皮抑素治疗肺外其他恶性肿瘤的研究

2.4重组人血管内皮抑素治疗恶性浆膜腔积液的研究

2.5重组人血管内皮抑素联合放射治疗的研究

2.6重组人血管内皮抑素其他的治疗方法

3.1不良反应发生的机制

3.2心脏、血管系统不良反应

3.3非心血管系统不良反应

综述参考文献

致谢