触觉刺激诱发小鼠小脑浦肯野细胞突触传递及长时程可塑性机制研究

摘要

第一部分摘要
　　小鼠小脑皮层感觉信息处理中的动力学特征
　　目的：感觉信息可通过爬行纤维和苔状纤维-颗粒细胞途径传入，在小脑皮层内依据内部的整合和运算产生运动相关输出。感觉信息在小脑皮层传递过程中，可诱发颗粒细胞层、分子层和浦肯野细胞层场电位反应，但感觉信息诱发小脑皮层各层场电位反应的动力学特征还没有明确，浦肯野细胞对感觉反应的频率特征还不清楚。因此，我们采用电生理学记录和药理学方法研究感觉刺激诱发小脑颗粒细胞层，分子层和浦肯野细胞反应的动力学特征，探讨小脑浦肯野细胞对感觉刺激反应的频率特性。
　　材料与方法：实验动物选用6-8周的成年HA/ICR小鼠，经腹腔注射每公斤体重为1.3g的乌拉坦麻醉，剪去触须后，小鼠行气管切开术并固定在脑立体定位仪上。之后在小脑 CrusⅡ的对应位置钻一个1-1.5mm的孔暴露出小脑表面，仔细去除硬脑膜，脑表面用蠕动泵持续灌流富氧的人工脑脊液(ACSF)。触觉刺激采用的是吹风刺激同侧触须垫（刺激持续时间5-500ms，刺激强度60psi）。触觉刺激与电生理学记录同步进行。记录电极用ACSF填充，阻抗约为3-5 M?。电生理学数据分析采用Clampfit10.3软件，所有数据采用均数±标准误表示，并应用SPSS17.0软件进行配对T检验或单因素方差分析，P＜0.05被认为实验组之间有统计学差异。
　　结果：
　　（1）吹风刺激（持续时间在5-10ms）同侧触须垫可诱发颗粒细胞层和分子层单峰的反应，然而，在颗粒细胞层当刺激持续时间大于或等于30ms时，分子层刺激持续时间大于或等于60ms时，均诱发出双峰反应，与经由苔状纤维途径传入的刺激开始和结束反应相符。
　　（2）颗粒细胞层对高频率的刺激反应敏感，可达到33Hz；相反，分子层的反应频率仅到4Hz。
　　（3）低频刺激（0.25-2Hz）对小脑浦肯野细胞的传出特性影响显著，但对高频率（≥4Hz）感觉刺激的反应不敏感，只对第一和第二个脉冲刺激反应。
　　（4）阻断 GABAA受体的活性，1Hz感觉刺激的每个脉冲均可诱发浦肯野细胞产生简单峰电位，但4Hz感觉刺激还只是第一个和第二个脉冲可诱发浦肯野细胞简单锋电位放电。
　　结论：
　　（1）小脑颗粒细胞对苔状纤维传来的感觉信息具有高频率和高保真特性，但这些高频信息在分子层被中间神经元修剪。
　　（2）小鼠小脑皮层浦肯野细胞对感觉信息输出具有低频特性，而且不受GABAA受体介导的抑制所影响。
　　（3）小鼠小脑皮层中间神经元在处理高频率感觉信息时起着低通滤过作用，并且在浦肯野细胞感觉相关传出方面起关键作用。
　　第二部分摘要
　　触觉刺激诱发在体小鼠小脑浦肯野细胞内源性大麻素依赖性的GABA能LTD
　　目的：小脑长时程突触可塑性被普遍认为是运动学习的细胞机制。大量研究描述了小脑平行纤维—浦肯野细胞（PF-PC）、平行纤维—分子层中间神经元（PF-MLI）和苔状纤维—颗粒细胞（MF-GrC）突触可塑性的诱发机制，但目前，感觉刺激诱发活体动物小脑皮层分子层中间神经元—浦肯野细胞（MLI-PC）突触可塑性的诱发机制还不清楚。因此，本研究在乌拉坦麻醉下采用细胞贴附式记录技术和药理学方法，研究面部触觉刺激串诱发小鼠小脑 MLI-PC突触 GABA能突触可塑性的表达及其机制。
　　材料与方法：实验采用6-8周龄的HA/ICR种小鼠，乌拉坦腹腔注射麻醉(1.3 g/kg).小鼠行气管切开术避免呼吸阻塞，行开颅术暴露小脑表面对应Crus II区。脑表面用蠕动泵持续灌流含氧的人工脑脊液0.5 ml/min。采用体温维持仪检测并维持直肠温度在37.0±0.2℃。触觉刺激采用的是吹风刺激同侧触须垫（刺激持续时间10ms，刺激强度60psi）。待触觉刺激诱发MLI-PC突触传递反应稳定10分钟后，分别给予1Hz，2Hz和4Hz的240脉冲(10 ms,60 psi)刺激，研究刺激前后MLI-PC突触传递变化情况。数据采用mean±SEM表示，组间比较采用ANOVA(posthoc multiple comparison; SPSS软件)测定统计学显著性水平。P值小于0.05被认为实验组之间有统计学显著性差异。
　　结果：
　　（1）以1Hz而不是2Hz，4Hz的面部刺激可诱导产生一个持久的MLI-PC突触GABA能突触传递抑制，同时伴随着浦肯野细胞简单锋电位暂停的降低。
　　（2）MLI-PC突触的GABA能LTD可以被CB1受体阻断剂阻断，并可被CB1受体激动剂药理学诱导产生。
　　（3）在mGluR1阻断剂（JNJ16259685）存在下，1Hz面部感觉刺激诱导MLI-PC突触 GABA能 LTD依然存在，然而，在NMDA受体阻断剂存在下，1 Hz面部感觉刺激不能诱导MLI-PC突触 GABA能 LTD的表达。
　　结论：
　　在小鼠小脑皮层Crus II区，触觉刺激可通过活化NMDA受体，诱导产生内源性大麻素依赖性MLI-PC GABA能突触传递长时程压抑。研究结果提示触觉刺激诱导的MLI-PC GABA能突触可塑性可能参与活体动物的运动学习。

目录

声明

LIST OF ABBREVIATIONS

Chapter 1 Dynamic properties of sensory information processing in mouse cerebellar cortex

1.1 Introduction

1.2Materials and Methods

1.2.1 Animals

1.2.2 Experiment equipment

1.2.3Anesthesia and surgical procedures

1.2.4Electrophysiological recordings

1.2.5 Sensory stimulation

1.2.6Drug administration

1.2.7Statistical analysis

1.3 Results

1.3.1Facial air-puff stimulation-evoked distinct field potentials cerebellar ML, PCL and GCL

1.3.2Dynamic properties of facial stimulation-evoked field potentials in the GCL

1.3.3Dynamic properties of facialstimulation-evoked field potentials in the ML

1.3.4Frequency properties of facial stimulation-evoked extracellular responses in PCs

1.3.5 Effect of GABAA receptor antagonist on facial stimulation train evoked responses in PCs

1.4 Discussion

1.4.1Cerebellar GCL expresses high frequency and high fidelity properties during the sensory information processing

1.4.2Cerebellar cortical molecular layer acts as a low-pass filter during the sensory information processing in cerebellar cortex.

1.4.3Cerebellar PCs generate sensory related output is limited to low frequency sensory information inputs

1.5 Conclusions

1.6 References

Chapter 2 Tactilestimulation induced the endocannabinoids-dependent GABAergic Long-term depression at cerebellar Purkinje cellsin vivoin mice

2.1 Introduction

2.2Materials and Methods

2.2.1 Animals

2.2.2 Experiment equipment

2.2.3Anesthesia and surgical procedures

2.2.4In vivocell-attached recordings

2.2.5 Sensory stimulation

2.2.6 Chemicals

2.2.7Statistical analysis

2.3 Results

2.3.11Hzfacial stimulation induced LTD of GABAergic transmission at PCs in mouse cerebellar cortex

2.3.21HzFacial stimulation induced LTD of GABAergic transmission at PCs, but without significant change the properties of sensory-evoked response in MLIs

2.3.3Induction of MLI-PC GABAergic LTD required activation of CB1 receptors

2.3.4Induction of MLI-PC GABAergic LTD required activation of NMDA receptors, but not mGluR1

2.4 Discussion

2.4.1Repeated facial stimulation induced LTD of GABAergic transmission at MLI-PC synapsesin vivoin mice

2.4.2Possible mechanismsofthe sensory inducedMLI-PC GABAergic LTDin vivoin mice

2.5 Conclusion

2.6 References

Review: Synaptictransmission and plasticity in cerebellar cortex

Publications

致谢