P2x7受体基于NLRP3炎症小体调控酒精性脂肪肝和肝纤维化的作用机制研究

摘要

目的:肝纤维化是一种发生在肝脏、循序而渐进的病理损伤，随着肝纤维化研究的不断深入，发现肝纤维化过程中炎症反应始终贯穿始终。P2x7受体(purinergicreceptor, P2x7R)属于嘌呤受体家族，是P2x家族的7个不同亚型(P2x1-7)中的一种。它在人体中分布广泛，特别是与炎症反应过程直接相关。因而是否可以通过影响P2x7R来实现对酒精性脂肪肝的调控，摸索其中的潜在联系与机制，是我们要探究的问题。
　　方法:(1)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）预处理巨噬细胞的培养基间接刺激人系肝星状细胞株LX2细胞与直接LPS刺激LX2细胞的组别相比较，ELISA与Western Blot检测细胞因子白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，白介素-1α(Interleukin-1α，IL-1α)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)表达情况。Western Blot与RT-PCR检测蛋白与mRNA的表达水平;LX2细胞给予LPS刺激4h，加入三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)时间为30min，加入ATP前10min给予P2x7R拮抗剂A438079。Western Blot与RT-PCR验证LX2细胞激活过程中炎症因子P2x7R、NOD样受体家族成员(NLRs) NLRP3和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specificproteinas，caspase-1)表达。同时检测肝纤维化标志蛋白Ⅰ型胶原(typeⅠ collagen，collagenⅠ)和平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)蛋白mRNA表达情况;沉默P2x7R后检测相关炎症小体与肝纤维化相关基因的表达。(2)建立硫代乙酰胺(Thioacetamide，TAA)肝纤维化模型，采用C57BL/6小鼠随机分为3组:正常组(n=5)，模型TAA组(n=14)与模型TAA给药A438079组(n=5)。除正常组，第一周腹腔注射给予TAA(100 mg/kg)给药，从第二周到第六周内TAA(200mg/kg)，从第5周起给药组每周给予A438079（30mg/kg）3次，持续两周。第6周给药结束后处死，收取血清，肝脏等样本。苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、免疫组化法(Immunohistochemistry, IHC)、麻松三色染色(Masson's Trichrome Staining)、免疫荧光染色(ImmunofluorescenceStaining，IF)检测炎症相关因子NLRP3、核转录因子(Nuclear factor kB，NF-kB)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和F4/80的表达情况。结合Western Blot与RT-PCR检测肝纤维化相关标志collagenⅠ、α-SMA的表达。(3)对小鼠肝脏细胞(AML12)给予酒精(50mM)、二甲双胍与AMP依赖的蛋白激酶(AMPdependent kinase，AMPK)通路抑制剂Compound C刺激24h，利用Wertern Blot检测炎症因子与脂肪代谢相关沉默信息调节因子（Sirtuin1，SIRT1）、过氧化物增殖剂激活受体(Peroxisome proliferatoractivated Receptor-alpha, PPARα)蛋白表达结果，凋亡相关因子半胱天冬酶3，即caspase-3表达情况。(4)慢性酒精加急性酒精灌胃模型，采用C57BL/6小鼠随机分为4组:对照饲料组，慢性酒精加酒精急性灌胃组，酒精给药组以及单独给药组。给药组每天皮下注射给药A438079(30mg/kg)。实验阶段，分别给予对照饲料与酒精饲料10天喂养。第11天单次酒精灌胃的计量为5g/kg，9小时后处死并收集样本。利用Western Blot与RT-PCR检测炎症因子与肝纤维化标志因子的蛋白与mRNA表达情况，对肝脏病理切片进行染色分析肝纤维化与炎症因子浸润情况。
　　结果:(1) LX2细胞经过LPS刺激后分泌IL-1β和IL-1α。LX2细胞经过LPS与ATP联合作用，肝纤维化相关各项指标collagenⅠ、α-SMA以及P2x7R和caspase-1、NLRP3炎症小体的mRNA与蛋白表达升高;预处理P2x7R拮抗剂A438079可以有效降低上述因子的表达。(2) TAA所致的肝纤维化模型中，A438079可以在体内降低TAA引起的caspase-1、NLRP3炎症小体与纤维化指标标collagenⅠ、α-SMA和TIMP1的蛋白与mRNA表达，在病理学上改善模型组的病变情况。(3)在AML12细胞中，A438079可以有效降低酒精诱发的PPARα、caspase-3、P-AMPK、SIRT1的蛋白表达。(4)慢性加急性酒精灌胃模型中，P2x7R拮抗剂A438079可以降低酒精诱发的ALT/AST指标升高，在病理学上改善模型组的病变情况以及collagenⅠ、α-SMA、P-AMPK、SIRT1、LIPIN1的蛋白表达。
　　结论:P2x7R介导的NLRP3炎症小体激活可以促使IL-1β分泌，间接促进肝纤维化的发生发展，在肝脏中调节酒精性脂肪肝进程。说明P2x7R在肝纤维化和酒精性脂肪肝治疗过程中会是一个有效的研究靶点。

目录

声明

摘要

Abbreviations

第一章 绪论

一、肝星状细胞的激活

二、肝星状细胞激活中的信号通路与炎症反应

三、P2x7R在酒精性肝病的作用

2．1．1 实验动物

2．1．2 实验试剂与仪器

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．2 细胞处理方法

2．2．3 酶联免疫吸附测定

2．2．4 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶活性测定

2．2．5 总RNA的提取和逆转录

2．2．6 细胞提取与蛋白印迹分析

2．2．7 免疫化学分析

2．2．8 小RNA干扰实验

2．2．9 小鼠TAA所致肝纤维化模型建立

2．2．11 动物肝脏切片的制作与染色

2．2．12 蛋白印迹检测相关蛋白

2．2．13 数据处理

第三章 实验结果

3．1 LPS刺激的条件培养基对肝星状细胞活化作用

3．2 P2x7R参与肝星状细胞激活

3．3 A438079抑制LX2细胞胶原的合成与沉积

3．4 沉默P2x7R基因可阻断LX2细胞激活与炎性应答

3．5 P2x7R选择性拮抗剂A438079调控TAA所致小鼠炎性因子与肝纤维化指标

3．6 酒精对AML12细胞中炎症小体及脂肪代谢因子的影响

3．7 P2x7R拮抗剂A438079对酒精所致小鼠肝脏脂肪蓄积的作用

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

博士在读期间获得成果