不同碳源条件下草菇（Volvariella volvacea）葡聚糖内切酶诱导表达的分析

摘要

草菇在生长发育过程中会合成和分泌多种纤维素降解酶,以降解和利用棉籽壳、木屑、稻草等纤维素类培养料,但因为纤维素大分子不可能直接进入菌丝体内,因此菌丝合成的纤维素降解酶必须分泌到菌丝体外才能发挥作用.前期研究表明 V.volvacea可以产生三种纤维素酶即内切型纤维素酶即葡聚糖内切酶(EC3.2.1.4),外切型纤维素酶(EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)等多种成分.本实验选择了葡聚糖内切酶EG1作为研究对象,研究了碳源对草菇葡聚糖内切酶合成的诱导调控机理. 真菌纤维素酶是一种诱导酶,碳源同时也是主要的诱导物来源.实验中利用了western blotting技术检测了不同碳源诱导下EG1的分泌,结果发现草菇产纤维素酶的诱导源很宽,α-乳糖、纤维二糖、羧甲基纤维素、微晶纤维素、麸皮等均能诱导草菇产生EG1;在含有微晶纤维素的液体培养基中生长10天,EG1在草菇菌丝中有高效表达;在天然稻草为基质的固体栽培料生长时,草菇EG1的表达和草菇菌丝生长与出菇相对应,分别在菌丝生长期、分化期、菇体成熟期EG1的分泌量达到最大. 为了更深入的研究碳源对EG1的诱导表达,我们重点研究以α-乳糖、纤维二糖、山梨糖为碳源诱导草菇EG1的分泌,结果发现α-乳糖、纤维二糖均能诱导EG1的高效表达,而山梨糖却不能;又对不同浓度的α-乳糖和纤维二糖诱导24小时进行研究,结果发现在低浓度时也均能诱导EG1的表达,α-乳糖在浓度为0.5％诱导表达量最大,纤维二糖则是在浓度为2％诱导表达量最大;当两种糖共同作用时,山梨糖阻遏了α-乳糖对EG1的诱导,却对纤维二糖诱导影响不大;而当α-乳糖和纤维二糖共同作用时使EG1的表达滞后. 实验中利用RT-PCR技术研究了草菇中葡聚糖内切酶基因eg1在α-乳糖诱导下转录水平的表达,加入α-乳糖诱导3个小时后用RT-PCR方法检测eg1的诱导表达,在4.5小时表达信号最强,随后9小时表达减弱,24小时后表达变得非常弱.

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

前言

第一章文献综述

1.1草菇概况

1.1.1草菇的分类地位

1.1.2草菇栽培的起源与发展

1.1.3草菇菌丝生长发育的条件

1.1.4草菇的生殖和生活史

1.1.5草菇的营养与药用价值

1.2纤维素酶

1.2.1纤维素酶的组成和性质

1.2.2产生纤维素酶的微生物

1.2.3纤维素酶的作用机制

1.2.4纤维素酶的应用

1.3葡聚糖内切酶

1.4纤维素酶合成的调控

1.4.1组成型的纤维素酶

1.4.2酶的诱导调控

1.4.3分解代谢物阻遏

1.5纤维素酶表达的检测方法

1.5.1酶活测定

1.5.2 Western blotting

1.5.3半定量RT-PCR

第二章重组葡聚糖内切酶的纯化及其一级抗体的制备

2.1材料

2.1.1菌种

2.1.2实验药品

2.1.3实验试剂

2.1.4仪器

2.1.5培养基

2.2方法

2.2.1葡聚糖内切酶活力的测定

2.2.2蛋白质含量的测定

2.2.3重组葡聚糖内切酶的表达

2.2.4重组葡聚糖内切酶的纯化

2.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.6葡聚糖内切酶一级抗体的纯化

2.3结果与分析

2.3.1葡聚糖内切酶酶活标准曲线的制作

2.3.2蛋白质含量测定标准曲线的制作

2.3.3重组葡聚糖内切酶的培养、分离和纯化

2.3.4亲和层析柱纯化一级抗体

2.4 讨论

2.5 小结

第三章Western blotting技术检测草菇胞外葡聚糖内切酶EG1的诱导表达

3.1材料

3.1.1供试菌株

3.1.2实验药品

3.1.3实验器材

3.1.4培养基

3.2方法

3.2.1草菇诱导产酶培养

3.2.2 Western blotting

3.3结果与分析

3.3.1不同碳源对草菇EG1的诱导

3.2.2微晶纤维素对草菇EG1的诱导

3.3.3天然稻草培养对草菇EG1的诱导

3.3.4 α-乳糖对草菇EG1的诱导

3.3.5纤维二糖对草菇EG1的诱导

3.3.6山梨糖对草菇EG1的诱导

3.3.7 α-乳糖与山梨糖对草菇EG1的诱导

3.3.8 α-乳糖与纤维二糖对草菇EG1的诱导

3.3.9纤维二糖与山梨糖对草菇EG1的诱导

3.4 讨论

3.5 小结

第四章半定量RT-PCR技术分析葡聚糖内切酶EG1的mRNA转录水平

4.1材料

4.1.1菌丝

4.1.2药品与试剂

4.1.3实验仪器

4.2方法

4.2.1总RNA提取方法

4.2.2 cDNA合成

4.2.3引物的设计

4.2.4 PCR扩增循环次数的确定

4.2.5内标基因(gpd)和目的基因(egl)的定量扩增

4.3结果与分析

4.3.1 α-乳糖诱导下不同时间草菇菌丝总RNA提取结果

4.3.2 PCR扩增循环次数的确定

4.3.3 gpd基因和egl基因在最佳循环数条件下的PCR扩增

4.4 讨论

4.5小结

总结

参考文献