穿龙薯蓣的快速繁育、RAPD鉴定及有效成分分析的研究

摘要

植物是药物的重要来源之一，人类利用药用植物的历史渊远流长。今天，尽管科学家已经能够利用化学方法研制品类繁多的药品，但开发利用植物药的热情在世界范围内却有增无减。这主要是由于植物种类丰富，体内所含的有效成分形形色色，具有开发新药的巨大潜力；既可以从中直接发现新药源；又可以发现新的先导化合物，通过结构修饰等术发明新药。中国野生药用植物种质资源非常丰富，据统计在5000种以上，但传统的中草药获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，当采集和耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种濒危甚至灭绝。此外，自然生态环境的日益恶化，也进一步导致药用植物资源的匮乏。 应用植物组织培养生产药用植物，具有不受地区、季节与气候限制，便于工厂化生产等优势，同时组织培养中的细胞生长速度要比植物正常生长速度快，接近于分生组织的生长速度，因此利用组织培养手段快速繁殖药用植物种苗，或者利用组织培养或细胞培养手段直接生产药物便随之日益发展。目前药用植物组织培养的应用主要有两个方面：一是利用试管微繁生产大量种苗，以满足药用植物人工栽培的需要；二是通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养，从细胞或培养基直接提取药物，或通过生物转化、酶促反应生产药物。 穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino)，在系统分类学中隶属于单子叶植物纲(Monocotyledoneae)、百合目(Liliales)、薯蓣科(Dioscoreaceae)薯蓣属(DioscoreaL)植物。分布全国，主产于陕西、内蒙古、黑龙江、四川、安徽、江苏等省。其具有消炎、祛痰、平喘、增加冠脉流量、降低血脂、改善心血管功能及抗菌、抗病毒等药理活性，还可减慢心率，增强心肌收缩力，增加每日尿量，改善冠脉循环，降低动脉血压，尤其适用于轻度动脉硬化。 由于甾体激素类药物的临床疗效独特，穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元又是合成甾体激素的主要原料之一，薯预皂苷的发现和利用为获得资源丰富和经济的天然甾体原料开辟了途径。 近年来，由于其生存环境的破坏和人类的大量采挖，其野生资源已经不多，处于严重的濒危状态，现已被列为国家二级保护植物。市场需求量较大，亟需进行人工繁殖和栽培。 综上所述，选育皂苷元含量高的穿龙薯蓣新品种已成为提高穿龙薯蓣开发效益和保护穿龙薯蓣野生资源的首选课题。本文选取吉林省长白山区野生穿龙薯蓣为试验对象，进行了植物分子生物学、生物化学等相关研究： 1．以穿龙薯蓣的茎段为外植体，摸索适合穿龙薯蓣组织培养的优化培养基和培养条件，建立穿龙薯蓣再生体系；探讨各种因素对穿龙薯蓣组织培养过程中诱导再生植株形成及微块茎繁殖的影响。以多元设计进行试验，获得如下结果： (1) 在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+3％蔗糖的培养基中，芽诱导频率最高，达86％； (2) 蔗糖浓度为7％时，最适合微块茎生长； (3) 在培养基中同时添加6-BA和NAA时，在6-BA0.5-2.0 mg/L和NAA0.5-2.0mg/L的范围内，两种激素的协同作用促进微块茎的诱导； (4) 在6-BA 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+7％蔗糖的培养基中，获得较重的微块茎，最大鲜重达3.46 g； (5) 1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+2％蔗糖+0.1％活性碳的培养基是穿龙薯蓣离体培养时最适合的生根培养基，最高生根率为95％； (6) 试管苗移栽到室外大田中，存活率为91％。 2．摸索以RAPD法分析穿龙薯蓣的最佳实验条件，对不同栽培方式的穿龙薯蓣进行DNA多态性分析，结果表明，穿龙薯蓣再生植株的九个引物电泳出的带纹与野生穿龙薯蓣植株的相同，再生苗植株和野生植株的所有片段都表现出了同源性。 3．在利用细胞培养技术建立穿龙薯蓣再生体系的基础上，分别超声提取薯蓣皂苷，以比色法测定不同栽培方式的穿龙薯蓣中有效成分含量，结果表明，人工栽培和野生穿龙薯蓣，其皂苷含量接近，组培的穿龙薯蓣，皂苷含量略低。 4．以常规方法制备根茎水提煎剂，测得三者的提取率接近，野生品为8.77％，栽培品为8.49％和7.59％。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

一、薯蓣属植物的研究进展

(一)薯蓣属植物的分类及系统学研究

(二)薯蓣属植物的资源分布及生态学研究

(三)薯蓣属植物的形态解剖学研究

(四)薯蓣属植物的天然产物化学研究

(五)薯蓣属植物的组织培养及细胞学研究

(六)薯蓣属植物的栽培学研究

(七)薯蓣属植物的遗传育种学研究

(八)薯蓣属植物的医药开发及综合利用的研究

二、植物组织培养的研究综述

(一)植物组织细胞培养的发生与发展

(二)植物组织(细胞)培养技术的应用

(三)植物组织(细胞)培养技术存在的问题

三、穿龙薯蓣研究概况

(一)穿龙薯蓣中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的开发利用研究

(二)穿龙薯蓣中薯蓣皂苷和薯蓣皂苷元的提取工艺研究

(三)穿龙薯蓣中薯蓣皂苷元测定方法的研究概况

四、植物遗传多样性研究概况

(一)植物遗传多样性

(二)分子标记技术及其在药用植物资源研究中的应用

五、本文的研究内容及意义

第一章穿龙薯蓣组织培养和植株再生体系的建立

一、材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二、结果与分析

(一)穿龙薯蓣带芽茎段的组织培养

(二)微块茎生长

(三)生根和再生植株生长

三、讨论

(一)激素对穿龙薯蓣再生苗诱导及微块茎形成的影响

(二)不同浓度的蔗糖对穿龙薯蓣微块茎生长的影响

(三)培养基及培养条件的对穿龙薯蓣组织培养的影响

第二章穿龙薯蓣再生植株DNA多态性的RAPD鉴定

一、概述

二、实验材料与方法

(一)实验材料

(二)实验方法

三、结果与分析

(一)穿龙薯蓣DNA样品分析

(二)RAPD引物筛选结果

四、讨论

第三章穿龙薯蓣有效成分的提取和测定

一、材料和方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二、结果与分析

三、讨论

第四章全文总结和创新点

一、结论

(一)穿龙薯蓣再生体系的建立

(二)穿龙薯蓣再生植株遗传稳定性的分子生物学检测

(三)不同栽培方式的穿龙薯蓣生物化学分析

二、创新点

三、有待于继续研究的内容

参考文献

致谢

作者简介

在读期间公开发表论文及著作情况

在读期间参加科研项目情况

附录