一年生野生大豆(Glycine soja)和栽培大豆(G.max)的DNA甲基化多样性和遗传多样性研究及copia-like反转录转座子反转录酶分析

摘要

大豆属于豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papiliomatae）菜豆族下的一个小属。一年生野生大豆（Glycine soja）和栽培大豆（G．max）都是分属这个属的两个种。一年生野生大豆（G． soja）是栽培大豆（G．max）的直接祖先，是我国作物资源中的宝贵财富。野生大豆在自然条件的选择下，形成了极其丰富的变异类型，这些品种可能含有大豆生产中迫切需要的关键性基因，是选育新品种，开展生物技术研究取之不尽，用之不竭的基因来源。栽培大豆起源于中国，在中国的栽培历史有5000多年，而且栽培大豆的分布与一年生野生大豆相似，都极为广泛。栽培大豆在漫长的人工驯化过程中和环境因素的影响下，形成了非常丰富的栽培品种。本文采用20份一年生野生大豆和27份栽培大豆研究了DNA甲基化多样性和遗传多样性，这些材料来源于吉林省农科院。MSAP（Methylation Sensitive Amplified Polymorphism）分析用了27对引物，共产生了984条带。进一步将MSAP数据分为甲基化敏感多态性（Methylation—Sensitive Polymorphism， MSP）和甲基化不敏感多态性（Methylation—Insensitive Polymorphism，MISP）。一年生野生大豆和栽培大豆的MSP和MISP分别为34．65％ vs．47．05％和34．76％vs．47．15％。这些数据表明，无论是MSP还是MISP都是栽培大豆高于野生大豆，这一结果与AFLP的结果不相一致（AFLP表现为野生大豆的多样性高于栽培大豆的多样性）。这说明发生瓶颈效应的基因型可以产生多种多样的表观基因型。根据这三类分子标记做的聚类图都可以将这些材料分为两个明显的群体，而且每个群体都主要分别由野生大豆和栽培大豆组成。此外，MSAP聚类分析暗示存在物种特异的表观遗传多态性，并可稳定的遗传下去。但是由于野生大豆和栽培大豆之间的渐渗现象，使得聚类分析中有个别栽培大豆与野生大豆聚为一类。将测序的MSP多样性条带进行了BLAST分析，结果显示12/24与己知功能基因或者推测蛋白质基因高度同源。相关性分析结果表明MSP和MISP以及MSP和AFLP之间没有相关性，暗示表观遗传多态与遗传多态形成和/或维持的机制是不相同的。DNA甲基化在大豆的起源进化与驯化过程中的作用将进一步讨论。 copia—like类反转录转座子是基因组中可移动的转座元件，是属于ClassⅠ类型的RNA类反转录转座子，含有长末端重复序列（long terminal repeat，LTR），这类反转录转座子是植物基因组中存在最为广泛的转座元件。本文利用copia—like类反转录转座子反转录酶的保守区域设计引物，从两个野生大豆基因组中扩增得到了反转录酶基因片段序列。对扩增得到的246bp左右的片段进行分离和克隆，并随机挑选了150多个克隆进行测序，得到了131条不同的序列。根据序列比对和系统进化分析，这些序列可分为19个群体，其中17个群体含有多条序列，2个群体各含1条。而且，来源于这两个一年生野生大豆的反转录酶序列是非常相似的。在这19个群体中，有12个群体是由来自两个野生大豆的序列组成的。但是，这些核苷酸序列组内和组间具有较大的差异，显示出其核酸序列的高度异质性。这些序列中有63条是“完整的”，也就是没有移码突变和/或终止子，其余的有移码突变、终止子或者是二者均有。这些结果暗示：每个群体都是由同一个祖先演化而来，而且有的序列有产生活跃转座子的潜力。从这些群体中选择具有代表性的序列作为Southern杂交的探针。Southern杂交结果显示了这些序列在一年生野生大豆和栽培大豆中都是非常保守的，有些序列在一些个体中表现出拷贝数的差异，没有发现野生大豆或者栽培大豆特有的序列。这表明，可能这些序列在进化上比较年轻，或者是由于大豆通过同源重组的方式减少LTR类转座子的速度大大慢于其它植物所致。同时，DNA甲基化分析也显示一年生野生大豆和栽培大豆中，copia—like反转录转座子序列均为高度保守，而且都是既含有高甲基化的位点/成员，也含有低甲基化的位点/成员。这一结果与已知的DNA甲基化的主要功能之一是通过抑制转座子和反转座子等的活性来维持基因组的稳定性的观点相一致。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部一年生野生大豆(G.soja)和栽培大豆(G.max)的DNA甲基化多样性和遗传多样性研究

引言

一、野生大豆研究现状

二、栽培大豆研究现状

三、DNA甲基化和转座子的研究对于野生大豆和栽培大豆多样性研究的相关性

四、本文选材和选题依据以及目的和意义

材料和方法

材料来源与实验方法

结果与分析

讨论

结论

第二部分一年生野生大豆(G.soja)中反转录转座子反转录酶的克隆和分析

引言

1、反转录转座子及其研究进展

材料和方法

1、目的片断的克隆和测序分析

2、测序及序列分析：

3、转膜和杂交

结果与分析

1、一年生野生大豆中copia-like反转录转座子反转录酶序列的PCR扩增产物及其序列分析

2、DNA测序分析

3、Southern杂交结果分析

讨论

结论

参考文献

致谢

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