远缘物种花粉授粉引起受体基因组遗传和表观遗传变异的现象及可能机制的研究

摘要

远缘杂交在植物界中频繁发生，在基因组进化和新种形成中具有创造性作用。由远缘杂交所产生的杂交种，异源多倍体以及渐渗杂交种与其亲本相比往往会出现大量遗传和表观遗传上的变异。但是我们仍然不知道的是来自有性上不亲和物种的花粉授粉在没有发生异缘渐渗的情况下，是否会导致一种“胁迫”，从而引起受体基因组的遗传和表观遗传不稳定性。为了探讨这一问题，本文研究了来自于有性上不亲和的两个远缘物种--水稻和稗草杂交所产生的后代，并且获得了一个在表型上有明显变异的水稻突变体后代(称之为Rb0)。首先，通过荧光显微镜技术，对这种水稻与稗草远缘渐渗杂交的受精行为进行了观察，发现稗草花粉可以在水稻柱头上萌发，并且花粉管可以生长至水稻子房部位，甚至到达珠孔。随后，通过对Rb0进行供体基因渐渗分析，结果显示没有稗草DNA渗入的证据。对Rb0及其自交后代S1代的鉴定可以排除由于花粉或其他品种种子污染或者多倍化等诱因造成上述表型变异的可能。虽然没有检测到稗草基因渐渗的证据，但是这种来自远缘物种花粉的授粉却引起了水稻突变体Rb0及S1代转座子的激活，其中包括MITE类转座子mPing及其转座酶供体Pong，LTR类反转座子Tos17和Osr42；以及一些反转座子的甲基化变异，包括Tos17和Osr36。
　　 利用AFLP租SSR分子标记技术对水稻突变体Rb0及S1代进行基因组遗传稳定性分析，结果显示稗草花粉胁迫诱导产生了遗传变异，包括碱基突变、碱基的缺失与插入以及微卫星序列重复次数的改变。同时，利用MSAP技术对突变体Rb0及其S1代进行了基因组范围表观遗传稳定的分析，结果显示稗草花粉胁迫同样导致了广泛的表观遗传变异，主要包括基因组整体DNA甲基化水平的提高和位点特异的模式改变。并且，这些在Rb0中所表现出来的表型变异以及遗传和表观遗传变异不仅能够以较高的频率传递给子代(S1代)，而且在子代中又出现了Rb0所没有的新变异，暗示具有“跨代基因组不稳定性”的特点。
　　 为了探究上述遗传变异的原因，运用实时定量PCR技术，对选定的维持基因组稳定性的错配修复基因(mismatch repair，MMR)进行了研究，分析结果显示，无亲缘关系物种间的相互作用可以导致后代Rb0及其连续2个自交后代的维持基因组稳定性的错配修复基因表达的可遗传的改变。
　　 同时，为了探究上述表观遗传变异的原因，对维持染色质表观修饰状态的基因的表达进行了同样的分析，结果显示无亲缘关系物种间的相互作用也可以导致维持染色质结构和状态的表观修饰基因表达可遗传的改变。最后为了验证这类基因表达变异在这种“胁迫”过程的普遍性，对以同样方法获得的月见草花粉胁迫的水稻表型突变体及其自交后代做了同样的分析，结果显示这些基因的表达也发生了改变，而且大多数变化是可遗传的。
　　 以上结果暗示着这些与维持染色质结构相关的基因表达的变异是远缘物种花粉胁迫所导致的遗传和表观遗传不稳定性的一个诱因。
　　 综上可知，来自远缘物种花粉的授粉可能对受体基因组造成一种胁迫，从而引起遗传和表观遗传的不稳定。鉴于这项杂交实验的简单性，不难想象类似的事件可以发生在自然情况下。同时本实验结果为“不亲和远缘杂交”在育种上的应用提供了初步的理论依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

引 言

1.远缘杂交的研究进展

1.1 植物远缘杂交的普遍性与新种的形成

1.2 植物远缘杂交引起的基因组变异和表观遗传变异

2.DNA甲基化的研究进展

2.1 DNA甲基化概述

2.2 植物DNA甲基化酶控制的DNA甲基化

2.3 植物DNA去甲基化酶

2.4 植物RNA介导的DNA甲基化

3.DNA甲基化与转座子活性

4.错配修复基因的研究进展

5.本文研究的背景、目的和意义

材料与方法

1.实验材料

1.1 供体材料

1.2 受体材料

1.3 渐渗杂交后代

2.实验方法

2.1“复态授粉法”获得水稻突变体

2.2 稗草花粉水稻柱头上的萌发及花粉管生长动态观察

2.3 植物基因组DNA的提取与纯化

2.4 Southern杂交分析

2.5 AFLP和MSAP分析

2.6 转座子展示

2.7 微卫星(SSR)多态性分析

2.8 PCR产物的纯化与克隆

2.9 感受态细胞的制备、转化及α互补筛选

3.0 DNA序列测定及同源性探寻

3.1 植物总RNA的提取和Real-Time PCR

结果与分析

1.稗草花粉粒在水稻柱头上的萌发及花粉管生长动态观察

2.稗草花粉胁迫获得水稻表现突变体Rb0

3. 稗草基因渐渗的可能性分析

4. 稗草花粉胁迫诱导水稻突变体Rb0及其自花授粉S1代中mPing、Pong转座子的激活

4.1 应用Southern blot技术检测突变体Rb0及其自花授粉后代mPing、Pong转座子的激活

4.2 利用转座子展示技术检测突变体Rb0及其S1代中mPing跳出、插入位点

5. 稗草花粉胁迫诱导水稻突变体Rb0及其自花授粉S1代中LTR类反转座子的激活及DNA甲基化变异

5.1 突变体Rb0中LTR类反转座子的激活及在自交世代中的遗传

5.2 突变体Rb0中LTR类反转座子的甲基化变异及在其自交世代中的遗传

6. 稗草花粉胁迫对水稻突变体Rb0及其S1代基因组整体稳定性的影响

6.1 利用AFLP的方法检测水稻突变体Rb0及其S1代基因组稳定性

6.2 水稻突变体Rb0及其S1代的DNA多态性序列的特征分析

7. 稗草花粉胁迫对水稻突变体Rb0及其S1代DNA甲基化水平遗传和变异模式的影响

7.1 利用MSAP的方法检测水稻突变体Rb0及其S1代DNA甲基化水平的遗传和变异

7.2 水稻突变体Rb0及其S1代甲基化变异模式

7.3 水稻突变体Rb0及其S1代甲基化变异序列的特征分析

8 稗草花粉胁迫诱导突变体Rb0及其S1代非编码区微卫星序列的变异

8.1 利用SSR的方法检测水稻突变体Rb0及其S1代非编码区微卫星序列的变异

8.2 S1代微卫星多态性序列的特征分析

9 稗草花粉胁迫导致S0和S1代植株错配修复基因的表达变异

10 稗草花粉胁迫导致S0和S1代植株染色质表观修饰基因的表达变异

11 稗草花粉胁迫诱导水稻S2代植株错配修复基因的表达情况

12 稗草花粉胁迫S2代植株染色质表观修饰基因的表达情况

13 月见草花粉胁迫导致水稻突变体Tong211-LP及其后代与维持染色质结构的表观遗传修饰的基因的表达变异

讨论

结 论

参考文献

附 录

致 谢

在学期间公开发表论文及著作情况