植物病原真菌对人参茎叶皂甙的生物转化

摘要

人参是我国传统中药，具有多种药理学作用，如抗肿瘤、延缓衰老及增强机体免疫力等。研究表明，人参中含有人参皂甙、糖类、蛋白质、多肽、氨基酸、维生素等物质。其中，人参皂甙是人参的主要活性成分，在干燥根中的含量约为3％-4％，在人参茎叶中的含量约为5％-7％。目前，已经从人参中分离出40多种人参单体皂甙，这些单体皂甙在人参中的含量不同，有些稀有人参皂甙在人参中含量很低甚至不存在，而这些稀有人参皂甙如Rd、Rg3、CK、Rh2等却具有重要的生物活性。直接从人参中大量提取稀有人参皂甙不符合实际，而利用生物转化的方法将人参中含量高的皂甙转化为稀有人参皂甙是一种切实可行的途径。由于人参茎叶中皂甙的含量高于人参根，因此，为了更加充分的利用人参资源，本文利用植物病原真菌转化人参茎叶皂甙来获得稀有人参皂甙。
　　本文的主要研究内容和研究结果如下:
　　(1)人参茎叶皂甙的分离纯化和分级:①利用大孔吸附树脂法从500.00 g干燥的人参茎叶中，分离出28.55 g人参茎叶总皂甙，得率为5.71％。②取10.00 g人参茎叶总皂甙，用硅胶柱层析法分离得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四种级分。其中，级分-Ⅰ3.22 g，得率为32.2％;级分-Ⅱ4.02 g，得率为40.2％;级分-Ⅲ1.53 g，得率为15.3％;级分-Ⅳ0.28 g，得率为2.8％。③TLC和HPLC检测，级分-Ⅰ主要含有人参皂甙Rg1和Rh1，是人参三醇型皂甙的混合级分;级分-Ⅱ主要含有Rd和Re，是二醇型皂甙和三醇型皂甙的混合级分;级分-Ⅲ主要含有人参皂甙Rb2和Rc及少量的Rb1;级分-Ⅳ主要含有人参皂甙Rb1。
　　(2)筛选能够转化人参皂甙的植物病原真菌;①从10种植物病原真菌中筛选出一种能转化级分-Ⅲ，且转化产物中含有稀有人参皂甙Rd、F2和CK的菌种—3.26号实验菌种。提取3.26号菌种的孢子液，并用孢子液转化级分-Ⅲ，结果表明，孢子液也能转化Rb1、Rb2和Rc，产生稀有人参皂甙Rd、F2和CK。②结合形态学和分子生物学技术，对3.26号真菌进行鉴定，结果表明，3.26号真菌与Epicoccum sp.SP318S rRNA的相似度为99％，属于附球霉属（Epicoccum LK.ex Wallr.）。
　　(3)糖苷酶的酶学性质分析:用DEAE-纤维素柱层析法分离纯化3.26号菌种分泌的糖苷酶，得到初步纯化的级分—E-Ⅰ。E-Ⅰ具有广泛的pH稳定性和温度稳定性，最适pH为5.0，最适温度为40℃。用E-Ⅰ分别转化人参茎叶皂甙级分-Ⅰ、级分-Ⅲ和级分-Ⅳ，结果表明，E-Ⅰ不能转化人参三醇型皂甙，但能快速转化人参二醇型皂甙Rb1、Rb2和Rc，产生稀有人参皂甙Rd，若延长转化时间则能产生稀有人参皂甙F2和CK，且底物皂甙完全转化。由此可见，糖苷酶E-Ⅰ能同时转化Rb1、Rb2和Rc，产物均为Rd、F2和CK，控制转化反应的时间，能选择性制备Rd、F2和CK。

目录

声明

摘要

主要中英文缩写词表

第一章 前言

1 人参茎叶皂甙的研究进展

1．1 人参皂甙的结构及分类

1．2 人参茎叶皂甙的提取与检测

1．3 人参茎叶皂甙的药理作用

1．4 应用前景

2 人参皂甙的生物转化

2．1 生物转化人参皂甙的研究进展

2．2 生物转化的应用前景

3 立题依据和研究内容

3．1 立题依据

3．2 研究内容和意义

第二章 人参茎叶皂甙的提取分离

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 仪器与试剂

2．3 人参茎叶总皂甙的提取及纯化

2．4 硅胶柱层析法分离人参茎叶皂甙

3 结果与讨论

3．1 人参茎叶总皂甙的提取

3．2 人参茎叶总皂甙的分离

3．3 小结与讨论

第三章 植物病原真菌转化人参茎叶皂甙

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验器材

2．2 筛选转化人参皂甙的菌种

2．3 真菌孢子转化人参茎叶皂甙的级分-Ⅲ

2．4 糖苷酶的制备

2．5 E-Ⅰ转化人参茎叶皂甙

2．6 转化产物的TLC和HPLC检测

3 结果与讨论

3．1 植物病原真菌的筛选

3．2 孢子液转化人参皂甙

3．3 DEAE-纤维素柱层析法分离纯化糖苷酶

3．4 E-Ⅰ的酶活性质

3．5 E-Ⅰ对人参茎叶皂甙的转化

3．6 小结与讨论

第四章 菌种的鉴定

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验器材

2．2 形态鉴定

2．3 基因组DNA的提取

2．4 基因组DNA的纯化及ITS的基因克隆

3 结果与讨论

3．1 菌落形态及显微观察

3．2 分子生物学鉴定

3．3 小结与讨论

总结

参考文献

致谢