桉树木质素合成途径两个关键基因的克隆与功能研究

摘要

桉树是世界上第二大人工造林树种,桉树木材亦是我国南方重要的造纸材料。木质素是植物中具有重要生物功能的次生代谢产物,是世界上第二位丰富的有机物,然而,纸浆生产中须将桉木原料中的木质素与用于造纸的纤维素分离,产生了大量的造纸废液,严重污染环境,并且增加造纸成本。培育低木质素的造纸植物新品种并推广应用正日益受到各国的高度重视,而通过RNAi转基因技术是实现低木质素育种的最快最优途径,亦是从源头上降低植物木质素含量的最有效办法。因而,克隆桉树木质素合成调控关键基因是对桉树进行木质素基因工程改良的基础,具有重大意义。本论文主要研究结果如下:
　　 1.桉树CAD和4CL基因的全长克隆。以赤桉叶片和茎为材料,分别提取DNA和RNA,并将DNA与RNA反转录的cDNA作为模板,根据桉树其它物种的CAD和4CL基因的核苷酸序列保守区域,利用专业软件PrimerPremier5.0设计引物,通过PCR及RT-PCR技术扩增出两个基因的DNA片段和cDNA片段,将产物克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,并进行测序验证。
　　 2.赤桉CAD和4CL基因的生物信息学分析。通过生物信息学软件Vector NTI9.0对测序结果进行分析:CAD全长基因组序列为2304 bp,cDNA长1102 bp,含有一个1068 bp的编码框,编码356个氨基酸残基；4CL全长基因组序列为5481 bp,cDNA序列1670 bp,含有一个1632 bp的编码框,编码544个氨基酸残基。通过GenBank上的序列比对,结果表明该序列与其它物种的CAD和4CL基因的一致性达到97％以上,可确认此序列是赤桉的CAD和4CL基因的全长序列。将两个基因的基因组与cDNA序列分别进行比对,发现两个基因都有5个外显子,4个内含子。应用蛋白质分析软件对这两个cDNA序列推导的蛋白质序列的理化性质、二级结构、三级结构等进行分析与预测。结果显示:CAD蛋白的等电点为5.705,分子量为38.775KDa；3个跨膜结构域,有一个信号肰剪切位点,且此蛋白是一个亲水蛋白,富含α螺旋和β折叠。4CL蛋白等电点为5.095,分子量为59.332KDa,存在4个跨膜区域,有一个信号肰剪切位点,该蛋白二级结构主要以α螺旋为主,并在其氨基酸序列上存在两大绝对保守域,即SSGTTGLPKGV和GEICIRG,其中SSGTTGLPKGV被认为是4CL催化反应中保守的AMP结合功能域。
　　 3.赤桉CAD和4CL基因的原核融合表达。设计了两对特异表达引物,分别选用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ,构建了融合表达载体pET-32a-CAD和pET-32a-4CL,并成功在大肠杆菌中表达。结果显示:CAD在3h的时候,表达量达到最大；4CL在2h时候,表达量较大,3h和4h时候,表达趋于平稳,变化不大。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

1 木质素生物合成途径及基因调控研究进展

1.1 前言

1.2 木质素的组成与分类

1.3 木质素的生物合成途径

1.3.1 木质素单体的合成

1.3.2 木质素单体的聚合

1.4 木质素含量和组成的基因调控研究

1.4.1 低木质素突变体

1.4.2 木质素含量及组成的基因工程调控

1.5 本研究的目的意义、主要内容和技术路线

2 桉树CAD和4CL基因的全长克隆

2.1 材料与试剂

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株与质粒

2.1.3 药品与试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 桉树总DNA提取

2.2.2 桉树总RNA提取

2.2.3 cDNA第一链的合成

2.2.4 引物设计

2.2.5 PCR扩增

2.2.6 DNA片段的回收与纯化

2.2.7 感受态细胞的制备

2.2.8 T-A克隆

2.2.9 重组子鉴定

2.2.10 质粒DNA提取

2.3 结果与分析

2.3.1 桉树CAD和4CL的全长基因组DNA克隆

2.3.2 桉树CAD和4CL的全长cDNA克隆

2.4 小结与讨论

2.4.1 桉树CAD和4CL基因的全长克隆

2.4.2 桉树总DNA与总RNA的提取

2.4.3 引物设计

2.4.4 PCR扩增

3 桉树CAD和4CL基因的生物信息学分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与分析

3.2.1 桉树CAD的生物信息学分析

3.2.2 桉树4CL的生物信息学分析

3.3 小结与讨论

4 赤桉CAD和4CL的原核表达研究

4.1 材料与试剂

4.1.1 菌株与质粒

4.1.2 药品与试剂

4.1.3 主要仪器设备

4.2 实验方法

4.2.1 原核表达载体的构建

4.2.2 CAD和4CL的原核融合表达

4.3 结果与分析

4.3.1 桉树CAD和4CL的原核表达质粒构建

4.3.2 桉树CAD和4CL的诱导表达

4.4 小结与讨论

5 结论与创新

5.1 结论

5.2 创新点

参考文献

附录

致谢