湖南马尾松种子园遗传多样性研究

摘要

本文以湖南城步马尾松种子园(亲本)和桂阳种子园(子代)为研究对象,利用ISSR分子标记技术马尾松种子园亲子代的遗传多样性和遗传结构。主要研究方法和结果如下:
　　 1、采用改良的CTAB法提取了马尾松基因组总DNA,所提取的DNA含量较高,经检测其浓度适合ISSR-PCR扩增反应。
　　 2、建立了适于马尾松ISSR-PCR扩增的最佳反应体系:总体积是20μL。包括1.5μL的2.5 mmol/L dNTPs,1.5μL的2 mmol/L MgCl2,2.0μL的10×PCR buffer,0.6μL的引物primer,0.2μL的5 U/μL Taq DNAploymerase,2μl的15 ng/μL的DNA template。PCR最优扩增程序是:94℃预变性5 min后,PCR扩增35个循环,每个循环94℃变性30 s,56℃变性45 s,72℃延伸2 min,最后一个循环结束,然后在72℃延伸7 min,最后4℃保存。
　　 3、利用ISSR分子标记技术对湖南城步马尾松种子园的4个种源区的117个无性系的马尾松遗传多样性进行了研究。采用了10个ISSR引物扩增共获得了218个标记位点,其中有210个为多态位点,多态位点比率为96.33％。不同种源区多态位点百分率在88.99％～90.37％之间。其中两广种源区的多态位点百分率最高,达90.37％,说明其种源内遗传变异水平在4个种源区中是最高的。总的Shannon多样性指数为0.5030,Nei’s遗传多样性指数为0.3347。各个种源区的遗传一致度的变化范围在0.9689～0.9812之间,各群体间的基因分化系数为0.0393,基因流为12.2219。四个种源区间Nei’s遗传距离UPGMA聚类分析结果表明,遗传距离(0.0190)最小的为雪峰山地种源区与贵州种源区首先聚类,雪峰山地种源区、贵州种源区与南岭山脉种源区依次聚类,遗传距离最大(0.0316)的是两广种源区与贵州种源区,两广种源区在遗传距离上与其他3个种源区的聚类相距较远,这与其地理分布格局大致吻合。
　　 4、从100条ISSR引物中筛选出11条多态性引物,对湖南桂阳马尾松第二代种子园共87份样品进行遗传多样性分析,共扩增得到246个多态位点。采用PAUP4.0软件分析,获得两个主要群体(广西群体和城步群体),在城步群体内,湖南和贵州两省的家系被分开。再对两个主要群体采用POPGEN32软件分析,结果表明:在桂阳第二代种子园内总的多态位点百分率达98.80％,总的Shannon信息指数为0.5837,Nei’s基因多样性指数为0.4003,两个群体的多态位点百分率分别为93.57％、98.80％,各群体间的基因分化系数为0.0363,基因流为13.2586。这表明桂阳第二代马尾松种子园的遗传多样性水平高,个体间的基因多样性变异大,保持较宽的遗传基础,该种子园所采用的建园方式是可取的。
　　 5、对亲、子代种子园群体的遗传距离聚类分析表明,遗传距离与地理分布具有一定的相关性。亲子代种子园的遗传多样性都比较丰富,而且子代种子园并没有因为种子来源是优中选优的个体而降低其遗传多样性,说明亲子代种子园的建园方式是值得借鉴和参考的。

目录

文摘

英文文摘

1 论义综述

1.1 马尾松概况

1.1.1 马尾松的形态特征

1.1.2 我国马尾松的分布情况

1.1.3 马尾松的牛长条件

1.1.4 马尾松的经济价值

1.2 种子园研究概况

1.2.1 种子园的发展历史

1.2.2 种子园面临的问题

1.3 遗传多样性概况

1.3.1 遗传多样性的概念

1.3.2 遗传多样性的研究方法

1.4 马尾松遗传多样性的研究进展

1.4.1 马尾松的表型性状变异研究

1.4.2 马尾松的细胞学研究

1.4.3 马尾松同工酶标记研究

1.4.4 马尾松分子标记研究

1.5 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验地简介

2.1.2 供试材料的采集

2.2 主要实验设备、试剂及所需溶液配制

2.2.1 主要实验设备

2.2.2 主要试剂

2.2.3 丰要实验溶液配制

2.3 实验方法

2.3.1 马尾松总DNA的提取、纯化及检测

2.3.2 马尾松ISSR-PCR扩增反应体系

2.3.3 引物筛选与扩增

2.3.4 数据处理与统计分析方法

3 结果与分析

3.1 马尾松DNA提取结果与质量检测

3.2 马尾松ISSR-PCR最佳反应体系的建立

3.2.1 DNA模板对ISSR-PCR反应体系的影响

3.2.2 引物浓度对ISSR-PCR反应体系的影响

3.2.3 dNTPs对ISSR-PCR反应体系的影响

3.2.4 Mg2+对ISSR-PCR反应体系的影响

3.2.5 TaqDNA聚合酶对ISSR-PCR反应体系的影响

3.2.6 退火温度对ISSR-PCR反应体系的影响

3.2.7 ISSR-PCR反应体系延伸时问的确定

3.2.8 循坏次数对ISSR-PCR反应体系的影响

3.2.9 ISSR-PCR最佳反应体系与反应程序

3.3 引物筛选结果

3.4 种子园遗传多样性分析

3.4.1 亲本种子园遗传多样性分析

3.4.2 子代种子园遗传多样性分析

3.4.3 亲子代种子园遗传多样性比较分析

3.5 群体间遗传距离分析

3.5.1 亲本种子园分析

3.5.2 子代种子园分析

4 结论与讨论

4.1 马尾松总DNA提取的探讨

4.1.1 实验材料

4.1.2 DNA提取方法

4.2 ISSR-PCR反应体系及实验的稳定性探讨

4.3 扩增产物的电泳和判读

4.4 马尾松种子园遗传多样性的分析

4.5 群体分化

4.6 进一步的工作方向

参考义献

附录 A ISSR-PCR扩增的部分谱带

附录 B 缩略词表

附录 C 攻读学位期间的主要学术成果

致谢