绵毛优若藜冷胁近均一化全长cDNA文库构建及EST分析

摘要

绵毛优若藜是原产美洲大陆的一种沙漠常绿灌木，是荒漠牧场冬季和春季的重要灌木饲草，近年来已在我国西北成功引种。绵毛优若藜的恶劣环境适应性极强，可在零下30℃、年降雨量为70—500mm、pH值为7．0—9．0的逆境中生长，具有极强的抗冻、抗干旱、耐高温、耐盐碱、耐贫瘠、耐沙埋等优点，拥有宝贵的抗逆性基因资源。因此，本文开展绵毛优若藜冷胁迫的均一化全长cDNA文库构建，进行大规模的随机测序，并对表达基因进行EST分析与生物信息学注释，获取冷胁迫抗逆基因资源信息，有利于解析荒漠常绿灌木的抗冻分子机制，为我国抗寒基因工程和转基因利用提供理论依据和物质基础。获得了以下主要结果：
　　 (1)采用Creator SMART技术与DSN相结合方法，构建了绵毛优若藜冷胁迫均一化全长cDNA文库，文库的库容量为1．4×106克隆，插入片段的大小基本上在0．25—3kb之间，平均长度大于1 kb，且文库重组率为100％，全长率为46．3％，完全达到了高质量的全长cDNA文库的建库要求。
　　 (2)随机挑取1248个克隆进行测序，成功测序1060条并构成绵毛优若藜冷胁迫的EST库。去除空载体和低质量的ESTs后，获得高质量ESTs为1041条，最短序列为100bp，最长为681bp，平均长度为551bp。
　　 (3)对1041条高质量EST库进行组装拼接后，获得1009条Unigenes，其中重叠群Contigs为60个，平均长度为656bp，最短序列为307bp，最长序列为1100bp。1009条Unigenes序列，长度跨度从100bp至1100bp，平均长度为558bp，低丰度基因Singlets(仅含一条EST)为978条，占总数的96．93％，表明均一化效果和文库质量极高。
　　 (4)对获得的1009条Unigenes进行ORF预测，得到946条ORF，序列长度最短为102bp，最长为981bp，序列平均长度为373bp。
　　 (5)对1009条Unigenes序列进行进行Blastn—Nt同源性分析，529条序列与已知序列有同源特征，占总数的52．43％，其中为推测功能基因的有312条，占总数的30．92％，未找到序列同源性的Unigenes序列有480条，占总数的47．57％。
　　 (6)对1009条Unigenes序列进行进行Blastx—Nr同源性分析，740条序列与已知序列有同源特征，占总数的73．34％，其中543条序列为推测功能基因，占总数的53．16％，未找到同源序列的有269条，占总数的26．66％。
　　 (7)对1009条Unigene序列进行Blast—COG分析，获得注释序列240条，占总数的23．79％。对Blast结果进行功能分类，得到22类：General function predictiononly; Posttranslational modification，protein turnover，chaperones; Energy productionand conversion; Amino acid transport and metabolism; Carbohydrate transport andmetabolism; Translation，ribosomal structure and biogenesis; Transcription; Lipidtransport and metabolism; Coenzyme transport and metabolism： Inorganic ion transportand metabolism; Function unknown; Replication，recombination and repair; Secondarymetabolites biosynthesis; transport and catabolism; Cell wall/membrane/envelopebiogenesis; Signal transduction mechanisms; Defense mechanisms; RNA processing andmodification; Nucleotide transport and metabolism; Intracellular trafficking，secretion，and vesicular transport; Chromatin structure and dynamics： Cell cycle control，celldivision，chromosome partitioning; Nuclear structure。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

1 绪言

1.1 绵毛优若藜研究概况

1.1.1 绵毛优若藜概况

1.1.2 绵毛优若藜的国内外研究现状

1.2 cDNA文库的构建及应用

1.2.1 cDNA文库的特点

1.2.2 cDNA文库的应用

1.2.3 全长cDNA文库的构建方法

1.2.4 均一化全长cDNA文库构建原理及方法

1.2.5 均一化全长cDNA文库的应用

1.3 EST技术及应用

1.3.1 EST概念及特点

1.3.2 EST的应用

1.4 生物信息学技术及其应用

1.4.1 生物信息学简介

1.4.2 生物信息学分析及其数据库

1.4.3 生物信息学应用

1.5 本研究的目的和意义

2 绵毛优若藜冷胁迫均一化全长CDNA文库的构建

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 绵毛优若藜总RNA提取

2.2.2 全长cDNA的合成

2.2.3 全长cDNA的均一化结果

2.2.4 DSN处理的cDNA的扩增

2.2.5 文厍鉴定

3 绵毛优若藜冷胁迫EST生物信息学分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料与试剂

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 测序结果及组装

3.2.2 Unigene功能注释

4 结论与讨论

4.1 绵毛优若藜总RNA提取

4.2 SMART法构建全长cDNA文库

4.3 文库的均一化

4.4 文库的质量评价

4.5 EST生物信息学分析

5 创新点

参考文献

附录一 :部分代谢途径分析图

附录二 :攻读学位期间的主要学术成果

致谢