大叶榉遗传多样性与离体保存研究

摘要

本研究通过叶绿体DNA的psbA-trnH、trnM-trnG序列分析以及微卫星分子标记(SSR)分析，对大叶榉（Zelkova schneideriana Hand.-Mazz.）遗传多样性，遗传结构，基因流等进行了研究。采用种子、茎段、叶片等外植体研究大叶榉的离体保存技术，阐述了大叶榉无菌活体（无菌芽和愈伤组织）的获取，芽继代增殖的影响因子，无菌芽和愈伤组织离体保存，单芽生根和组培苗移栽等内容。具体结果如下:
　　1.大叶榉遗传多样性
　　本研究通过对濒危植物大叶榉的12个居群144个个体的叶绿体DNA的psbA-trnH和trnM-trnG序列分析发现:大叶榉在物种水平上具有较高的遗传多样性，大叶榉居群间的遗传变异大于居群内的遗传变异，居群间基因交流较小，导致居群间存在较大遗传分化。
　　大叶榉物种水平的单倍型多样性（hdT）为0.737，核苷酸多样性（πT）为5.80×10-4。地区水平上，中国的遗传多样性较高，其次是美国，澳大利亚最低。居群水平，湖南桑植最高，其次为浙江桐乡，江苏句容、湖南怀化和湖北武汉最低，均为0。大叶榉在物种水平上的遗传多样性水平较高，究其原因，一、可能是由于其异交的繁殖方式，二、可能由于其祖先具有较广泛的遗传分布。
　　大叶榉群体55.17％遗传变异发生在居群间，44.83％的变异发生在居群内。对来自不同国家（中国、美国和澳大利亚）的大叶榉居群进行不分层次AMOVA分析显示，遗传变异主要存在于组内居群间(71.42％)。大叶榉群体的遗传变异主要来自于居群间的差异。基于叶绿体DNA序列数据，大叶榉居群的FST=0.551，在叶绿体水平上，Nm为0.408，表明大叶榉各居群间基因交流较小，导致居群间存在较大的遗传分化。而基因交流小，可能和大叶榉种子散播机制有关。
　　单倍型H3和H8位于网络图的内部，并且和外类群光叶榉（Zelkova serrata）相连，可能是祖先单倍型。整个Network网络图呈现2个分支，其中单倍型H6，H7，H8，H9在一个分支，其他单倍型聚为另一个分支。单倍型H4广泛分布于地理距离较远的6个居群中，可推测该物种的祖先可能具有较广泛的遗传分布。
　　采用双抑制PCR法开发出12对大叶榉SSR引物，用来自江西，安徽，美国的3个居群的55个个体检测SSR引物的多态性和3个居群的遗传多样性水平。
　　12对引物均表现出较高的多态性水平。SSR序列已上传到GeneBank，登录号:KJ749829～KJ749840。
　　遗传多样性研究结果表明:江西居群拥有最高的遗传多样性水平，其次为安徽居群，遗传多样性水平最低的是来自美国的居群。该结果和叶绿体DNA序列分析结果一致。
　　2.大叶榉离体保存研究
　　种子外植体的消毒可不受季节和天气的影响，茎段外植体消毒受季节影响较大。通过无菌播种，种子可直接萌发获得无菌芽。从茎段可直接诱导产生腋芽单芽或者腋芽丛生芽。种子或者幼嫩的叶片可以通过脱分化产生愈伤组织，然后由愈伤组织再分化产生无菌芽。
　　研究不同因素对大叶榉无菌芽继代增殖效果的影响。结果表明:BA对芽的增殖倍数有显著影响，木质化程度较高的腋芽丛生芽采用WPM+BA4.0 mg/L+KT2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L培养基可获得较高的增殖率。为避免芽体愈伤化，过于幼嫩的无菌芽在继代培养的前期，应在不添加BA的培养基上培养。附加2.0 g/LPVP的培养基能有效抑制组培继代芽的褐化。
　　较低激素水平的培养基适宜对大叶榉无菌芽和愈伤组织进行离体保存，而适当提高激素水平，特别是BA的水平，可以诱导愈伤组织分化出再生芽。低温保存可延长无菌芽和愈伤组织的保存时间。材料的来源（不同地方）对离体材料（无菌芽和愈伤组织）的保存效果没有显著影响。种子来源的愈伤组织比叶片来源的愈伤组织分化能力更强。
　　大叶榉单芽生根难度不大，使用WPM+ABT2.0或者WPM+IBA0.5均可以获得较高的生根率，木质化程度较高的单芽生根效果较好。大叶榉组培苗的移栽基质以红心土为佳。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 植物遗传多样性

1．1．1 研究意义

1．1．2 遗传标记

1．2 离体保存技术研究

1．2．1 缓慢生长保存

1．2．2 超低温保存

1．3 大叶榉研究概况

1．3．1 物种介绍

1．3．2 研究进展

1．3．3 大叶榉树遗传多样性与离体保存研究现状

1．4 存在的问题及本研究目的意义

1．4．1 存在的问题

1．4．2 本研究的目的与意义

第二章 大叶榉遗传多样性研究

2．1 基于cpDNA序列分析的大叶榉遗传多样性研究

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 结果与分析

2．1．4 讨论

2．2 大叶榉SSR引物开发及基于SSR的大叶榉遗传多样性研究

2．2．1 材料与方法

2．2．2 实验结果

2．2．3 讨论

2．3 小结

第三章 大叶榉离体保存研究

3．1 大叶榉愈伤组织与无菌芽的获取

3．1．1 大叶榉无菌播种

3．1．2 大叶榉茎段外植体消毒与初始芽诱导

3．1．3 大叶榉叶片外植体消毒、脱分化与再分化

3．2 大叶榉无菌芽继代增殖的影响因素研究

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果与分析

3．2．3 结论与讨论

3．3 大叶榉无菌芽离体保存的影响因素研究

3．3．1 材料与方法

3．3．2 结果与分析

3．3．3 结论与讨论

3．4 大叶榉愈伤组织保存的影响因素研究

3．4．1 材料与方法

3．4．2 结果与分析

3．4．3 结论与讨论

3．5 大叶榉单芽生根与组培苗移栽

3．5．1 材料与方法

3．5．2 结果与分析

3．5．3 结论与讨论

3．6 小结

第四章 总结与展望

4．1 大叶榉遗传多样性

4．2 大叶榉离体保存

4．3 未来研究展望

本研究主要创新成果

参考文献

附录 在读期间发表论文情况

致谢