人类胚胎干细胞特异性新基因HPESCRG1及小鼠同源基因mPESCRG1的分离鉴定和初步的功能分析

摘要

胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)是从早期囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)分离出来的一种多能性细胞,它具有自我更新和多向分化潜能的特征.1998年人ESCs(human ESCs,hESCs)系的建系成功给干细胞领域带来了突破性的进展.hESCs不但为研究人类早期胚胎发育过程提供了新途径,更重要的是它为遗传性疾病的基因治疗提供新的载体,为糖尿病、老年性痴呆、帕金森氏症等多种疾病的细胞和组织的替代治疗提供新的方法.第一章hESCs表达特异性基因的分离和鉴定,该研究以有自主知识产权的chESC-1为材料,采用SSH方法分离了一批hESCs差异表达的基因.在此基础上成功地克隆了hESCs特异性新基因HPESCRG1及小鼠同源基因mPESCRG1,综上考虑它们的序列特征和表达特性,HPESCRG1和mPESCRG1可能具有重要的生理功能,它们可能在维持ESCs不分化过程和哺乳动物胚胎早期发育过程中起作用.

目录

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专业名词缩写中英文对照表

实验技术路线图

前言

第一章人类胚胎干细胞特异性基因的分离和鉴定

1材料和方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4抑制消减杂交(SSH)接头与引物

1.5总RNA抽提

1.6 mRNA的分离

1.7RT-PCR检测Oct-4和AFP的表达

1.8 SMART-PCR获得全长cDNA

1.9抑制消减杂交

1.10 T/A克隆

1.11反向cDNA杂交

1.12半定量RT-PCR

1.13测序及同源性分析

2结果

2.1chESC-1及其分化细胞

2.2chESC-1及其分化细胞中Oct-4和AFP基因的表达

2.3LD-PCR预试验确定最佳循环数

2.4双链cDNA的合成、纯化

2.5双链cDNA的Rsa Ⅰ酶切

2.6双链cDNA与接头的连接效率检测

2.7 SSH产生的差异产物

2.8 SSH的消减效率分析

2.9 PCR检测阳性克隆

2.10反向cDNA斑点杂交结果

2.11半定量RT-PCR分析

2.12序列测定和同源性分析

3讨论

一、chESC-1的早期自发分化细胞主要是原始内胚层样细胞

二、筛选分离组织特异性基因的意义和研究方法

第二章HPESCRG1基因的克隆与生物信息学分析

1材料和方法

1.1材料与试剂

1.2主要仪器

1.3新基因序列分析

1.4 PCR引物

1.5总RNA抽提

1.6 5'UTR拼接序列的验证

1.7含完整编码区的cDNA克隆

1.8 JM109大肠杆菌感受态的制备

1.9 PCR产物连接转化

1.10阳性克隆的确定

1.11新基因序列的生物信息学分析

1.12质粒DNA的小量提取

1.13 Northern杂交

1.14用荧光原位杂交（FISH）技术进行新基因的染色体定位

2结果

2.1 EST拼接组装验证

2.2 HPESCRG1全长cDNA的分子克隆

2.3基因序列和蛋白质结构生物信息学分析

2.4 Northern杂交

2.5 FISH验证HPESCRG1基因的染色体定位

3讨论

一、候选基因HPESCRG1的全长cDNA的克隆

二、HPESCRG1基因结构和功能的生物信息学分析

第三章HPESCRG1基因的特性分析和功能的初步研究

1材料与方法

1.1材料

1.2目的基因

1.3 pEGFP-C2载体

1.4 PQE载体

1.5酶及主要试剂

1.6引物

1.7主要仪器

1.8各种组织总RNA抽提

1.9细胞总RAN的提取

1.10多组织RT-PCR

1.11多组织Northern杂交

1.12 chESC-1细胞及其分化细胞原位杂交

1.13小量质粒抽提

1.14胶回收目的片段

1.15 HPESCRG1蛋白的亚细胞定位

1.16 pQE30/HPESCRG1融合表达质粒的构建

2结果

2.1多组织RT-PCR

2.2 Northern杂交

2.3原位杂交分析

2.4 HPESCRG1蛋白的亚细胞定位

2.5 PQE/HPESCRG1融合表达载体的构建与筛选

3讨论

第四章mPESCRG1的分子克隆和表达特征的分析

1材料和方法

1.1材料

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4 pEGFP-C3载体

1.5蛋白序列比较分析

1.6 PCR引物

1.7 mESCs总RNA的提取

1.8 mPESCRG1基因的cDNA克隆

1.9利用SMART方法扩增获得mPESCRG1基因的5'端序列

1.10 mPESCRG1基因序列和编码蛋白特性分析

1.11Northern杂交

1.12小鼠多组织Northern

1.13小鼠囊胚的RT-PCR

1.14原位杂交

1.15 mPESCRG1蛋白的亚细胞定位

2结果

2.1蛋白同源性比较

2.2 mPESCRG1基因含完整编码区的cDNA克隆

2.3基因序列和编码蛋白的生物信息学分析

2.4 Northern杂交

2.5 RT-PCR分析

2.6原位杂交

2.7mPESCRG1蛋白的亚细胞定位

3讨论

参考文献

小结

综述：胚胎干细胞分子生物学研究进展

致谢

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