核结合因子在成骨细胞中的表达及其促骨髓间质细胞凋亡的作用机制研究

摘要

核结合因子在成骨细胞中的表达及其促骨髓间质细胞凋亡的作用机制研究第一部分：核结合因子(Cbfa1)在不同细胞系中表达的比较。目的：观察核结合因子(Cbfa1)在人成骨肉瘤MG63细胞、人成骨肉瘤Soas-2细胞、成人原代成骨细胞、小鼠骨髓间质细胞MBA-1、小鼠前成骨细胞MC3T3E1、小鼠破骨前细胞RW264.7和人软骨前体细胞SW1353中的表达，明确Cbfa1及其亚型在骨骼系统不同细胞系中的表达状态，及在代表不同成骨细胞发育阶段细胞系的中表达差异，探讨Cbfa1及其亚型表达与成骨细胞发育阶段之间的关系。 方法：从正常骨折病人骨组织中分离人成骨细胞。按细胞种系来源分两组，分别用半定量RT-PCR观察Cbfa1mRNA在小鼠来源(小鼠骨髓间质细胞、成骨前细胞、破骨前体细胞)及在人类来源(人成骨肉瘤细胞、成人原代成骨细胞、人软骨前体细胞)细胞中的表达。小鼠来源的细胞系还观察Cbfa1两种亚型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57的表达。用Western-blot检测各种细胞中Cbfa1蛋白的表达。用FITC+DAPI观察Cbfa1蛋白在成人原代成骨细胞和小鼠骨髓间质细胞MBA-1中表达的亚细胞定位。 结论：Cbfa1mRNA的表达可能与成骨细胞的分化阶段有关，小鼠来源的细胞系中以Cbfa1/P57亚型为主。Cbfa1蛋白的表达定位于细胞核内。 第二部分MC3T3E1细胞分化过程中核结合因子(Cbfa1)及各相关基因的表达目的：研究在小鼠前成骨细胞MC3T3E1诱导成骨过程中，总Cbfa1及Cbfa1两种亚型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57的表达随成骨细胞成熟过程的表达变化，观察碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素及与Cbfa1相关的两种转录因子MSX2、OSX在成骨细胞成熟过程中的变化。 方法：MC3T3E1细胞在β-甘油磷酸钠，抗坏血酸存在的情况下培养22天，在细胞培养的不同时间(0，4，10，14，18，22天)，用α-磷酸奈酚法测定碱性磷酸酶活性，半定量RT-PCR检测总Cbfa1mRNA及Cbfa1两种亚型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57mRNA和Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素mRNA以及MSX2、OSXmRNA的表达；用Western-blot检测MC3T3E1细胞成熟过程中不同时间点Cbfa1蛋白的表达；VanGieSon苦味酸酸性复红染色法染色细胞Ⅰ型胶原；茜素红染色观察矿化结节形成。 结论：在MC3T3E1细胞的分化过程中，培养的第10天以前为细胞增殖期，培养的第10天到第22天为骨基质形成并成熟矿化期。Cbfa1mRNA及Cbfa1蛋白的表达随成骨细胞的分化逐渐增高，以Cbfa1/P57mRNA亚型为主。Ⅰ型胶原、骨钙素、骨涎蛋白、骨桥素、OSX、MSX2mRNA随成骨细胞分化表达逐渐增高。 第三部分核结合因子(Cbfa1)诱导骨髓间质细胞MBA-1凋亡目的：研究Cbfa1的两种N末端亚型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57对骨髓间质细胞MBA-1凋亡的影响，探讨Cbfa1介导MBA-1细胞凋亡的机制。 方法：将带有Cbfa1/P56、Cbfa1/P57全长cDNA的质粒用脂质体方法瞬时转染到人骨髓间质细胞MBA-1细胞中，造成MBA-1细胞的Cbfa1高表达，72小时后用流式细胞仪观察细胞凋亡率的变化，DAPI+FITC染色观察细胞核的变化，并抽提蛋白进行Cbfa1及相关凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome-C、Caspase-3、Caspase-9和TNF-a的免疫印迹检测。 结论：Cbfa1两个N末端亚型Cbfa1/P56、Cbfa1/P57能诱导骨髓间质细胞MBA-1的凋亡。Cbfa1促进MBA-1凋亡的过程中有线粒体途径和膜受体途径的参加。凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome-C、Caspase-9和Caspase-3组成的信号级联反应构成了Cbfa1促进MBA-1凋亡的信号传导通路，TNF-a也参加了Cbfa1促进MBA-1凋亡的作用中。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

前 言

第一部分核结合因子(Cbfa1)在不同细胞系中表达的比较

结果

讨论

第二部分MC3T3E1细胞分化过程中的Cbfa1及其相关基因的表达

结果

讨论

第三部分核结合因子(Cbfa1)诱导骨髓间质细胞MBA-1的凋亡

材料与方法

结果

讨论

结语

参考文献

综述 Cbf与骨代谢

致 谢