体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞

摘要

研究背景：Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞受到细胞介导的自身免疫性破坏，自身不能合成和分泌胰岛素而造成的，是北美和欧洲儿童、青少年治疗困难的慢性疾病之一，平均发病率为0.2％，占所有青少年糖尿病总数的80％(PeckAB，2004)。为了维持血糖稳定，这些患者终生必须每天注射外源性胰岛素，给患者造成巨大的生理和心理痛苦。外源性的胰岛素难以完全模拟胰岛素正常生理分泌，容易引起机体血糖内稳定紊乱，出现酮症酸中毒、低血糖等严重后果。更危险的是，长期糖代谢紊乱而继发的糖尿病性微血管病变，导致的糖尿病慢性并发症如肾功能衰竭、失明、心脑血管疾病等，影响了患者的生活质量，也是造成患者死亡的主要原因。 胰岛移植为糖尿病治疗带来了曙光，理论上胰岛移植成功后不但能有效的控制血糖，而且可以恢复胰岛正常的生理功能，维持血糖内环境稳定，从根本上提高Ⅰ型糖尿病患者的生活质量。但是经过多年的临床应用，胰岛移植并没有达到预期的治疗效果，主要原因在于：①供体数量极其有限；②胰岛移植物的质量和数量难于控制；③移植物免疫排斥反应(SoriaB，2001)；④胰岛移植并不能延缓自身免疫反应的进展。如何解决这些问题，尤其是移植物的问题，成为提高胰岛移植，甚至细胞移植成功率的关键。 随着干细胞研究的不断深入，定向诱导干细胞分化为胰岛素分泌细胞甚至胰岛成为近年研究的又一热点。从胚胎干细胞(EmbryonicStemCells，ESC)诱导分化为胰岛素分泌细胞已经取得了一定进展(LumelskyN，2001；AssadyS，2001)，但是ESC建系和培养是比较复杂的，而且即使建立了ESC系，甚至定向诱导分化了足够的胰岛，对于移植受体来说，只能提供同种异体的移植物，免疫排斥的问题没有实质性解决。 近年来发现成熟动物个体内的间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)具有全能干细胞的特点，可以发生跨胚层的横向分化，这些发现为细胞移植治疗提供了新的来源。其中研究的最多的是骨髓MSCs，骨髓MSCs具有极强的自我更新能力及多向分化潜能(KrauseDS，2001)，最近研究显示骨髓移植后受体糖尿病鼠胰腺组织增生，生存率改善(IanusA，2003；HessD，2003)；更有研究发现骨髓MSCs体外能横向分化为产生胰岛素的细胞(OhSH，2004)，表达多种胰岛β细胞发育和功能相关的基因(JahrH，2003)。虽然骨髓MSCs向内分泌系统的研究已经取得了上述成就，但是其体外分化为胰岛效率低，胰岛素分泌量低，远远不能满足移植治疗糖尿病的需要(Dong-QiTang，2004)。如何提高其诱导分化率是困扰人们的难题。 胰腺十二指肠同源框-1基因(PancreaticDuodenalHomeobox-1，PDX-1)能调节多种β细胞功能相关基因表达，对胰腺器官发生和胰岛个体发育均具有重要作用；PDX-1能在ESC中调控胰岛素相关基因表达(MiyazakiS，2004)；将PDX-1基因转染某些非胰岛β细胞(如肝细胞、小肠上皮细胞)后，这些细胞可以产生胰岛素(FeberS，2000；YangLJ，2002)；如果能获得大量有生物活性的PDX-1基因转染骨髓MSCs，可能会提高骨髓MSCs体外诱导分化的定向性，增加诱导效率从而提供足量的供移植胰岛细胞，一方面分离患者自身骨髓MSCs进行诱导分化产生胰岛细胞进行白体移植可避免移植排斥反应，另一方面，骨髓移植可诱导微嵌合性，延缓自身免疫反应的进展，从根本上解决Ⅰ型糖尿病的问题，将在糖尿病细胞治疗中具有重要意义。因此本研究拟构建含有PDX-1基因的真核表达载体，探讨PDX-1基因表达在骨髓MSCs体外分化为胰岛样细胞中的作用，并同种异体移植观察骨髓MSCs来源的胰岛样细胞对链脲佐菌素(STZ)所致糖尿病模型大鼠的治疗效果，为胰岛移植和胰岛发育机制研究奠定基础。本试验分为三个部分： 一、胰腺十二指肠同源框-1基因真核表达载体的构建目的：构建含有PDX-1基因的真核表达载体，为糖尿病细胞移植奠定基础。 方法：提取胰岛细胞瘤细胞株总RNA，通过RT-PCR体外扩增大鼠PDX-1基因，经BglⅡ、HindⅢ双酶切后整合入经相同酶切的含绿色荧光蛋白(GFP)载体pEGFP-C2，构成重组质粒，再进行双酶切电泳筛选、鉴定并测序。 结果：扩增的目的片断经琼脂糖凝胶电泳显示在700bp和900bp之间呈现单一特异性条带；重组载体双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳显示一条850bp目的基因片断以及一条4.3kb的载体片断，表明PDX-1基因片断已被成功的插入到pEGFP-C2中；序列测定结果显示克隆的目的基因序列与GeneBank报道的基因序列一致。 结论：成功构建含有PDX-1基因的真核表达载体，为构建含PDX-1基因的工程细胞进行糖尿病的细胞/基因治疗奠定了基础。 二、Superfect高效介导外源性基因在骨髓间充质干胞表达目的：提高外源性基因在骨髓MSCs中的表达效率。方法：Percoll分离液培养大鼠骨髓MSCs，采用间接免疫荧光染色检测MSCs表面抗原表达；观察MSCs生长特性，绘制生长曲线，测定贴壁率；流式细胞仪检测细胞周期后，以Superfect介导含有目的基因PDX-1的重组载体转染骨髓MSCs，通过荧光显微镜观察转染效率和MTT检测细胞生存率对转染条件进行优化；间接免疫荧光染色检测PDX-1基因转染后瞬时表达后，G418筛选阳性细胞，通过荧光显微镜、RT-PCR和Westernblotting检测PDX-1基因在骨髓MSCs中的稳定表达。 结果：大鼠骨髓MSCs体外生长状况相对稳定，3代后倍增时间波动于55-56h；传代后12h，细胞贴壁率＞90％；间接免疫荧光显示MSCs不表达CD34，表达CD59、CD90.1；流式细胞仪显示细胞周期处于G0/G1期的细胞总数占85.9％，提示多数细胞处于静止期；重组载体和Superfect以1：4配比、孵育细胞3h时转染效果最佳；成功转染的细胞在荧光显微镜下显示全细胞绿色荧光，间接荧光免疫化学染色显示转染后细胞表达PDX-1；G418筛选后，荧光显微镜显示随着转染时间的延长，阳性细胞比例逐渐增多，与RT-PCR和Westernblotting结果相似。 结论：大鼠MSCs在体外培养下，生长性状稳定，适应性强；Superfect能高效介导外源性基因在骨髓MSCs中表达；转染外源性基因的MSCs可望成为一种理想的基因治疗的靶细胞。 三、PDX-1促进大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛样细胞目的：提高骨髓MSCs体外分化为胰岛样细胞的效率，为自体骨髓MSCs移植治疗糖尿病奠定基础。 方法：重组载体转染MSCs后G418筛选，随后进行分步法体外诱导分化；SABC细胞免疫化学染色和Westernblotting检测诱导后细胞胰岛素、胰高血糖素、生长抑素的表达；并用胰岛素ELISA试剂盒测定诱导后细胞的胰岛素分泌功能；最后进行同种异体移植观察重组载体转染的骨髓MSCs对链脲佐菌素(STZ)所致糖尿病模型大鼠的治疗效果；转染空白载体和未转染的骨髓MSCs作为对照。结果：诱导分化后骨髓MSCs聚集形成类似胰岛的团块状结构，随着培养时间的延长，逐渐有细胞从团块状结构周边增殖出来；免疫细胞化学染色显示诱导后在细胞团块中央出现大量胰岛素阳性细胞，伴随在边缘区域，出现数量不等的胰高血糖素、生长抑素阳性细胞；PDX-1+MSCs分化为胰岛素阳性细胞比率(28.23％±2.56％)高于转染空白载体和未转染的MSCs(PDX-1-MSCs)体外分化效率(阳性率分别为7.23％±1.56％和4.08％±2.69％)；WesternBlotting检测显示诱导后细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素蛋白，且PDX-1+MSCs上述蛋白表达明显增多，与细胞免疫组化结果相似；ELISA检测显示PDX-1+MSCs诱导后对不同浓度葡萄糖反应敏感(25mM高浓度葡萄糖和5mM低浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌量分别为115.29±2.56μU/mL和56.61±4.82μU/mL)；同种异体移植后可以恢复糖尿病模型大鼠的血糖水平，移植物平均存活时间30.5±15.7d。 结论：大鼠骨髓MSCs体外能分化为胰岛样细胞；PDX-1能显著增强大鼠骨髓MSCs体外分化为胰岛样细胞的能力；骨髓MSCs体外分化的胰岛样细胞移植能改善STZ糖尿病大鼠的生存状态。综上所述，本研究结论如下： 1.国内首次成功构建含有胰腺十二指肠同源框-1基因的真核表达载体。 2.在国际上率先应用新型纳米转染介质Superfect介导含有PDX-1基因的真核表达载体转染入骨髓MSCs，为骨髓MSCs作为糖尿病基因治疗的靶细胞奠定基础。 3.本研究在证明骨髓MSCs体外能分化为胰岛样细胞的基础上，随后发现PDX-1能促进骨髓MSCs体外分化为胰岛样细胞的能力，获得足够细胞进行自体骨髓移植治疗糖尿病奠定了实验基础。 4.本研究通过体内实验证明，骨髓来源的胰岛样细胞移植能改善STZ诱导的糖尿病大鼠的生存状态，为糖尿病治疗开辟了一条新的途径。

目录

文摘

英文文摘

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英文缩略词表

第一章胰腺十二指肠同源框-1基因真核表达载体的构建

1.前言

2.材料和方法

3.结果

4讨论

5.结论

附图

第二章Superfect高效介导外源性基因在骨髓间充质干细胞表达

1.前言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

5.结论

附图1

附图2

第三章PDX-1促进大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛样细胞

1.前言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

5.结论

参考文献

综述干细胞治疗糖尿病的研究进展

附件中国部分城市医院早产儿流行病学调查报告

致谢

攻读学位期间主要成果