神经元特异性基因mLRRC4是神经系统发育与轴突生长的功能基因

摘要

1985年日本人Takahashi在人血清富含亮氨酸的α-糖蛋白中发现LRR结构域(leucine-richrepeat)，包含LRR结构域的蛋白存在于从酵母到人的多个物种，在多种细胞的不同亚细胞结构上定位，具有不同的生理功能。现在被识别的LRR蛋白家族成员已经有四千多种。这种蛋白结构基序的最基本功能是为蛋白质的交互作用提供通用的结构框架。 研究表明一些LRR蛋白家族成员在果蝇神经系统的发育中扮演着重要角色。比如connectin与神经肌肉连接形成相关，slit参与轴突的发育，chaopin参与视杆细胞发育，tartan在神经和肌肉发育中发挥作用。近来在脊椎动物中也发现一些包含LRR和Ig结构的蛋白如LIG-1、LRRN6A、NGL-1在神经系统发育过程中时序性表达。hLRRC4(Homosapiensleucinerichrepeatcontaining4，hLRRC4，登录号：AF196976)是我室运用EST介导的定位候选克隆方法结合RACE技术从染色体7q31成功克隆的一个富亮氨酸重复超家族新成员。生物信息学分析表明hLRRC4基因编码653个氨基酸，核心区域由9个串联的LRR结构和包围它们的富含半胱氨酸的N端和C端LRR构成，此外还含有1个C2型免疫球蛋白(IgC2)结构域。 基于LRRC4的结构，我们推测LRRC4可能与神经系统的发育相关，然而考虑到道德因素和取材困难，我们不能用人来进行试验。因此我们克隆了与hLRRC蛋白相似性高达97％的小鼠的LRRC4基因，详细考察了mLRRC4在不同发育阶段小鼠个体中的表达情况，并用突起生长实验证明LRRC4促进神经突起生长，推测LRRC4基因可能参与神经系统的发育与正常功能的维持。 克隆小鼠LRRC4基因用生物信息学技术结合RT-PCR方法克隆了小鼠LRRC4基因并在基因GenBank登录(登录号：DQ177325)。新基因包含1959个碱基的开放阅读框，在起始密码子前有同框终止密码子。mLRRC4编码一个含有652个氨基酸的跨膜蛋白，后者分子量为72.6kDa，等电点为6.58。mLRRC4的胞外部分含有一段信号肽，核心部分由富含半胱氨酸的氮端和碳端结构域包裹9个LRR结构域构成，在靠近跨膜区还含有一个免疫球蛋白结构域。 将mLRRC4的LRR结构域进行多序列比对，每个LRR结构域都含有24个氨基酸残基。它们的一致序列为LxxLxLxxnxixxixxxaFxxLxx。 同时我们用电子克隆的方法克隆了大鼠LRRC4(登录号：DQ119102)和牛LRRC4(登录号：DQ164537)。用mLRRC4蛋白序列进行同源性搜索表明，mLRRC4与人、大鼠、牛的相似性分别是97％、99％、96％，此外我们还发现mLRRC4的蛋白序列与斑马鱼有70％的相似性。LRRC4家族成员都含有高度保守的LRRNT-(LRRs)9-LRRCT-IgC2，而且这些串联排列的结构域具有高度的保守性。在前期研究中，我们发现富含半胱氨酸的氮端和碳端结构域在许多含LRR结构域的粘附蛋白和受体中高度保守。由此可见，LRRC4可能是一个高度保守的蛋白家族，在系统发生中发挥着重要的生理功能。 mLRRC4是神经组织相对特异性基因提取成年小鼠各种组织的总RNA进行RT-PCR，结果显示mLRRC4在成年小鼠的心、脾、肝、肺、肌肉、子宫、胃均没有表达或表达很弱，而在30天和60天的脑组织中有高表达，是一个具有组织特异性的基因。 用原位杂交方法研究mLRRC4在中枢神经系统的表达模式。mLRRC4mRNA散在地分布于整个中枢神经系统，其阳性信号主要存在于胞浆，在某些细胞核周、胞核与突起中也有表达。在大脑皮层，mLRRC4在梨状前皮质后部，颞页皮质听区、丘脑上辐射区表达。在海马CA1、CA2区、齿状回的颗粒细胞强阳性表达，在丘脑内侧背核表达强阳性。mLRRC4在整个小脑中均有表达，特别是在小脑颗粒层和蒲肯野细胞层表达较强。在脊髓中mLRRC4主要在灰质表达。 为探讨mLRRC4是在神经元细胞还是在神经胶质细胞中表达，我们首先用mLRRC4探针对切片进行原位杂交，然后利用胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)抗体进行免疫组化实验，用碱性磷酸酶显色底物(BCIP/NBT)显色。结果显示，mLRRC4只在神经元中表达，而在神经胶质细胞中没有表达。 用原位杂交结合免疫荧光技术也同样证明mLRRC4在神经元表达。星型胶质细胞主要存在于小脑的髓质和皮质颗粒层，神经元主要存在于蒲肯野细胞层和颗粒层，在分子层和髓质分布的神经元较少。mLRRC4在GFAP阴性的区域呈现阳性反应，显示mLRRC4在神经元胞体和突起中均有表达。这说明mLRRC4是一个神经元特异性基因。 mLRRC4在鼠脑发育不同时段的表达抽提了不同发育阶段鼠脑的总RNA，并把它们转换成cDNA，RT-PCR结果显示了mLRRC4的mRNA在早期(E8.5)并不表达，E9.5天有表达，到E16.5天表达最高，此后mLRRC4的表达维持在一定水平。 mLRRC4探针整胎杂交结果在E12.5胚胎，mLRRC4探针分别在中脑、后脑、末脑等脑室和眼有明显杂交信号。而用预杂交液替代探针和加入十倍互补探针则没有颜色反应出现。 mLRRC4探针在胚胎切片组织中的表达状况进一步用切片原位杂交方法考察mLRRC4在小鼠E12.5胚胎的表达情况，mLRRC4在中枢神经系统所有器官均表达阳性。其中前脑泡、中脑、后脑、末脑及脉络丛、神经管表达阳性。在背根神经节表达强阳性。而其它组织如心脏、肝表达很低或没有表达。在阴性对照中，没有阳性信号。 mLRRC4在维甲酸诱导P19胚胎癌细胞分化过程中的表达状况小鼠P19胚胎癌细胞在维甲酸的诱导下能定向分化为神经元和神经胶质细胞，是体外进行哺乳动物神经细胞发育与分化分子机制的模型。用景乃禾教授赠予RA诱导P19分化模型各时段cDNA进行初步实验。结果表明mLRRC4在P19细胞中没有表达，在RA诱导第4天和分化阶段有表达。在P19诱导模型中，分化第1天即可检测到神经元特异性信号(如NSE等)的表达，到分化第7天开始检测到胶质细胞特异性信号(GFAP)表达，也就是说分化第一天开始出现神经元，分化第7天开始出现胶质细胞。因此，我们的结果提示mLRRC4可能参与了神经元的早期形成和分化，这一结果也从另一方面佐证了mLRRC4是一神经元特异性基因。 LRRC4促进海马细胞轴突生长同时包含LRR与Ig结构域的蛋白都被证明与轴突生长相关。膜蛋白LRRC4预测的蛋白结构表明这种蛋白很可能象其它具有这种结构的粘附分子一样通过介导细胞间的相互作用来促进神经再生。我们运用Tsuji的轴突生长实验方法来检测LRRC4是否具有这一功能。 18.5天海马被分离、剪切、消化后低密度种植到U251细胞和转染LRRC4的U251细胞中。种植48小时后细胞固定并用MAP2抗体检测神经突起，并用图像分析系统拍照分析。结果表明48小时后，在LRRC4/U251细胞中种植的海马神经元突起平均长度为70.7±14.3μm，要明显长于种植在野生型U251的神经元突起48.1±7.9μm(p＜0.001，ANOVA)。证明LRRC4能促进神经突起生长。

目录

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摘要

缩略词汇表

前言

技术路线图

第一章BALB-C小鼠LRRC4基因的克隆

1.1材料

1.1.1动物

1.1.2主要试剂

1.1.3菌株和质粒载体

1.1.4 PCR引物

1.1.5主要仪器

1.2方法

1.2.1计算机识别、功能分析方法

1.2.2测序载体的构建

1.3结果

1.3.1小鼠LRRC4基因的电子克隆

1.3.2分四段设计引物扩增小鼠LRRC4基因的可能序列并测序鉴定

1.3.3 cDNA序列及预测的蛋白分析

1.3.4 mLRRC4基因的染色体精细定位

1.3.5 mLRRC4氨基酸组成及LRR结构比对分析

1.3.6大鼠LRRC4与牛LRRC4基因的电子克隆

1.3.7 LRRC4家族成员相似性比对

1.4讨论

参考文献

第二章mLRRC4基因的表达

2.1材料

2.1.1动物标本

2.1.2引物

2.1.3寡核甘酸探针

2.1.4原位杂交检测试剂盒

2.1.5其它主要试剂

2.1.6主要仪器

2.2方法

2.2.1组织RNA的抽提

2.2.2差异RT-PCR

2.2.3神经细胞的原代培养

2.2.4原位杂交

2.2.5原位杂交结合免疫组化/免疫荧光

2.2.6焦油紫染色

2.3结果

2.3.1 mLRRC4在正常小鼠组织中的表达

2.3.2 mLRRC4在全身各组织中的分布

2.3.3 mLRRC4在眼中的分布

2.3.4 mLRRC4在神经系统中的分布

2.3.5 mLRRC4在神经元而不是胶质细胞中表达

2.4讨论

参考文献

第三章LRRC4基因参与神经系统发育与分化

3.1材料

3.1.1动物标本

3.1.2 P19细胞RA诱导分化各阶段的cDNA

3.1.3引物

3.1.4寡核甘酸探针

3.1.5原位杂交检测试剂盒

3.1.6其它主要试剂

3.1.7主要仪器

3.2方法

3.2.1组织RNA的抽提

3.2.2差异RT-PCR

3.2.3原位杂交

3.2.4整胚原位杂交

3.2.5神经突起生长实验

3.2结果

3.2.1 mLRRC4在鼠脑发育不同时段的表达

3.2.2 mLRRC4探针整胎杂交结果

3.2.3 mLRRC4探针在胚胎切片组织中杂交结果

3.2.4 mLRRC4在维甲酸诱导P19胚胎癌细胞分化过程中的表达状况

3.2.5 LRRC4促进海马细胞突起生长

3.3讨论

参考文献

结论

综述 富亮氨酸重复(LRR)的研究进展

致 谢

个人简历