TIMP-1转基因小鼠拮抗多次小剂量链脲佐菌素诱导糖尿病及其机制研究

摘要

背景与目的: 胰岛β细胞自身免疫性破坏导致1型糖尿病的发生，而其增殖能力非常有限，以至于在受到广泛破坏后不能够复制、新生足够有功能的胰岛β细胞。金属蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)作为一种多功能蛋白，可抑制基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)活性，调控多种类型细胞的增殖、凋亡，以及炎症反应，包括在体外拮抗细胞因子对大鼠胰岛β细胞及细胞株的毒性作用。本实验旨在观察，给予注射多次小剂量链脲佐菌素(multiple low dose streptozotocin，MLDS)后，人TIMP-1转基因小鼠(TG)过表达人TIMP-1对糖尿病发生、胰岛炎、胰岛β细胞凋亡及增殖的影响；并在NIT-1细胞中进一步验证其促存活及促有丝分裂作用，初步探讨了其作用机制。 方法: 鉴定并检测TG小鼠胰腺人TIMP-1表达，观察体重、血糖、血清胰岛素、糖耐量、胰岛素耐量等相关代谢参数；给予同周龄、体重匹配的TG小鼠和非转基因(CoN)小鼠链脲佐菌素(STZ)40mg·kg<'-1>·d<'-1>连续5d，观察小鼠尿量、饮水、摄食量、体重、血糖及死亡率变化，利用苏木素伊红(Hematoxylin-Eosin，HE)、胰岛素染色、脱氧核糖核酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling， TUNEL)染色及 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)标记等组织学及免疫组织化学方法评估胰岛炎、胰岛细胞β细胞凋亡、增殖及胰岛β细胞量的变化。转染并筛选稳定表达人TIMP-1的NIT-1细胞，通过MTT、Hoechst33342/溴化丙啶(PI)染色、BrdU摄取等方法，以及MMP、P13K及MEK抑制剂的应用，Western blot分析Akt、ERK磷酸化水平，验证TIMP-1拮抗STZ对β细胞的直接毒性作用，并初步探讨了TINIP-1上述作用的机制。 结果: (1)尾DNA PCR鉴定TIMP-1转基因小鼠，Northern blot分析表明，TG小鼠可见胰腺人TIMP-1高水平表达，而Con小鼠未见表达；相关代谢指标显示，Con与TG小鼠的空腹血糖、血清胰岛素水平、经腹腔葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验均无显著差异，胰岛α细胞的分布和所占胰岛比例也无显著差异。给予MLDS后，Con小鼠FBG显著升高，伴有明显的多尿、多饮、多食、体重减轻及酮症，低胰岛素血症，并在17周(w)内相继死亡；TG小鼠血糖升高程度相较低(2w：TG，13.0±1.3 mmol/L vs Con，24.5±1.6nzrnol/L，P<0.0001)，胰岛素水平虽然也明显下降，但仍然显著高于Con小鼠，并且在12w后TG小鼠血糖水平逐渐回落，胰岛素水平逐渐回升，大部分TG小鼠(83％)存活下来。组织及免疫组织化学分析显示，MLDS处理后Con小鼠约40％胰岛出现不同程度的胰岛炎(Ⅰ～Ⅳ级)、凋亡胰岛细胞显著增加及胰岛β细胞量严重丢失；而TG小鼠仅6％左右胰岛出现轻度胰岛炎(Ⅰ级)，显著低于Con组(P=0.000)，凋亡胰岛细胞显著少于Con组(P<0.05)，残存胰岛β细胞量显著高于Con组(P<0.05)，并且MLDS处理40 w后，胰岛β细胞量基本恢复正常；另外，胰岛β细胞增殖评估显示，MLDS处理后TG小鼠和Con小鼠胰岛细胞增殖均明显增加，TG小鼠增加更为显著(P<0.05)。 (2)G418筛选4 w获得稳定表达hTIMP-1的NIT-1细胞；STZ可呈时间和剂量依赖性的抑制NIT-1细胞活性，而过表达TIMP-1可拮抗STZ毒性，降低STZ诱导的NIT-1死亡，增加NIT-1的存活，但PI3K抑制剂LY294002及MEK抑制剂U0126可抵消其保护作用，MMP抑制剂GM6001、强力霉素均不能拮抗STZ对NIT-1细胞的毒性作用。Western blot分析显示，TIMP-1组Akt、ERK1/2磷酸化水平增加。 结论:过表达TIMP-1不仅可减轻MLDS诱导的高血糖，而且有利于胰岛遭破坏后的恢复；其机制可能与TIMP-1抗凋亡、促增殖作用有关，Akt和ERK途径可能参与了TIMP-1的上述作用。

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论文说明：英文缩略词表

声明

实验研究一TIMP-1转基因小鼠拮抗多次小剂量链佐菌素诱导糖尿病

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验研究二NIT-1细胞过表达TIMP-1拮抗链佐菌素毒性及机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

综述一：TIMP-1与糖尿病研究进展

综述二：金属蛋白酶抑制物与肾脏疾病研究进展

致谢

攻读学位期间发表文章情况