BrdU标记的HCMV感染HEL细胞、大鼠脑组织和U细胞的研究

摘要

目的(1)以标记在人巨细胞病毒(HCMV)DNA 上的BrdU为示踪剂，研究HCMV在HEL细胞中的移动规律；同时结合HCMV蛋白IEl及pp65的分布及表达特点探讨病毒复制增殖的过程。(2)建立BrdU标记HCMV感染SD大鼠脑组织的模型；探讨大鼠CNS神经元对HCMV的容许性，受染细胞数与病毒感染量和感染时间的相关性。(3)研究U<,251>细胞对HCMV的容许性，并探讨病毒蛋白IEl及pp65的分布及表达特点。 方法(1)以BrdU标记HCMV DNA，测定其PFU值；以MOI=4的病毒量感染HEL细胞，分别在2h p.i.、4h p.i.、6h p.i.、8h P.i.、12h p.i.、24h p.i.及48h p.i.时用抗BrdU单克隆抗体进行免疫细胞荧光染色；分别用抗HCMV蛋白IEl及pp65单克隆抗体进行免疫细胞化学染色；运用图像分析系统对免疫细胞化学染色结果进行灰度值测定，经统计分析探讨此两种蛋白的分布及表达特点。(2)将15只SD大鼠随机分为病毒感染组(12只)及对照组(3只)，病毒感染组根据感染时间分为三组：24h p.i.、48h p.i.及96h p.i.，每个感染时间组再分为2μl及4μl两个剂量组，均以脑内注射途径将BrdU标记的HCMV(MOI=4)直接注入大脑海马部位；每个感染时间组设立一只阴性对照，于同一部位注入不含病毒的细胞培养上清液(4μl)；术后分笼饲养，于各感染时间点处理鼠取脑，经固定、浸糖处理后冰冻切片，应用抗BrdU单克隆抗体及抗MAP<,2>单克隆抗体的混合抗体对海马周围部位脑片进行免疫荧光双标染色，应用抗病毒蛋白pp65单克隆抗体进行免疫组化染色及Nissil复染。(3)HCMV感染U<,251>细胞，于15min p.i.、30min p.i.、1h p.i.、2h p.i.、4h p.i.、6h p.i.、8h p.i.、10h p.i.、12h p.i.、14h p.i.、24h p.i.、48h p.i.、72h p.i.、96h p.i.及120h p.i.时分别用抗蛋白IEl及pp65单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，运用图像分析系统对免疫细胞化学染色结果进行灰度值测定，经统计分析探讨此两种蛋白的分布及表达特点。 结果(1)免疫细胞荧光染色结果提示病毒DNA依次位于胞质(2hp.i)、胞核(4h p.i.～24h p.i.)及同时位于胞核和胞质(48h p.i.)；免疫细胞化学染色结果显示：蛋白IEl仅在核内表达，表达量在4h p.i.达高峰后明显降低，至8h p.i.时不能检测到；蛋白pp65分布规律为胞核分布(4h p.i.～12h p.i.)、胞核与胞浆同时分布(24h p.i.)及巨细胞和融合细胞内分布(48h p.i.)，表达量于2h p.i.～6h p.i.间呈上升趋势，8h p.i.～24h p.i.稳定表达，48h p.i.表达降低。(2)24h p.i.，病毒感染组脑片中未检测到标记病毒及蛋白pp65；48h p.i.及96h p.i.，在海马CA1区神经元中检测到了标记病毒DNA的阳性荧光及蛋白pp65的阳性着色，并发现受染细胞数与感染剂量呈正相关，未发现与感染时间的相关性。(3)4h p.i.～120h p.i.均能检测到蛋白IE1表达于U<,251>细胞核内，表达量在14h p.i.前呈上升趋势、之后表现为下降趋势：蛋白pp65在1h p.i.～96hp.i.分布于核内，120h p.i.时分布于融合细胞内，蛋白pp65首先于1h p.i.时被检测到，至96h p.i.均呈持续低水平表达，于120h p.i.出现一表达高峰。 结论(1)运用示踪剂BrdU成功地探讨了HCMV在HEL细胞中的移动及复制增殖过程，此标记技术为更深入研究HCMV奠定了基础。(2)成功建立了以BrdU标记HCMV感染SD大鼠脑组织的模型：证明了大鼠CNS神经元对HCMV的容许性：由受染细胞量与感染剂量呈正相关，而与感染时间无关，推测HCMV在SD大鼠CNS中呈潜伏感染状态。(3)U<,251>细胞是HCMV的容许细胞；HCMV在U<,251>细胞内呈低水平复制状态；蛋白IEl及。pp65在U<,251>细胞内的表达具有量一时效相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

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前言

第一章BrdU标记的HCMV感染HEL细胞的研究

第二章BrdU标记HCMV感染SD大鼠脑组织模型的建立

第三章HCMV蛋白IEI、pp65在U251细胞中的分布与表达

第四章结论

参考文献

综述 先天性CMV感染致中枢神经系统畸形发育机制

致谢

攻读学位期间主要研究的研究成果