胃溃疡复发大鼠胃组织的蛋白质组学研究与健胃愈疡颗粒干预

摘要

背景:消化性溃疡(Peptic Ulcer,PU)是临床常见病、多发病,随着溃疡病治疗药物的进展,PU的近期愈合已不成问题,但其复发问题一直是溃疡病研究的热点和难点。胃溃疡(Gastric Ulcer,GU)作为消化性溃疡的常见类型,其复发是一涉及多因素改变的复杂过程,虽然从基因和转录水平已对其进行了许多成功的研究,但其病理机制仍不十分明确,尚缺乏有效的用于早期诊断及预后检测的特异性分子标志物,若能直接从蛋白质组学入手来研究,将能更全面、真实地揭示其病理机制,为GU复发的发病学、预防诊治以及新药开发提供新的线索。蛋白质组学的出现及其研究技术的发展和完善使得从蛋白质整体水平上研究GU复发及其溃疡相关性疾病的分子机制成为可能。
　　目的:1.研究白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)所致GU复发大鼠胃组织的蛋白质表达,探讨GU复发的相关发病机制;2.分析健胃愈疡颗粒(JianWeiYuYang granule,JWYY)干预IL-1β所致GU复发大鼠胃组织的蛋白质表达变化,探讨JWYY抗GU复发的作用机理。
　　方法:1.GU复发大鼠模型的制备及JWYY干预:①将80只大鼠随机分为4组,即正常对照组(10只)、假手术对照组(10只)、GU模型组(40只)、JWYY组(20只),采用改良的Okabe乙酸涂抹法复制实验性GU模型,正常对照组不造模,假手术对照组以生理盐水代替乙酸,造模后24h,JWYY组灌服JWYY药液,剂量为0.081g/1ml/100g体重,其余各组灌服蒸馏水,剂量均为1ml/100g体重,每天1次。造模后第90d,再将GU模型组大鼠随机分为GU模型组和GU模型复发组各半,采用IL-1β复制GU复发模型,正常对照组、假手术对照组、GU模型复发组、JWYY组大鼠分别腹腔注射IL-1β(1μg/kg体重),GU模型组以生理盐水代替IL-1β腹腔注射;②分别于造模后第8d、92d(即复发溃疡诱导后48h)均分2批处死各组大鼠,剖腹取胃,在对胃大体情况、胃溃疡指数(Gastric ulcer index,GUI)进行检测后,剪取胃窦部含溃疡处(无溃疡者则于相应部位取材)胃组织行HE染色(hematoxylin andeosin stain,HE stain)、双向凝胶电泳(Two dimensional electrophoresis,2-DE)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IH)、逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫印迹(Western blot)。2.GU复发大鼠胃组织蛋白质组学研究及JWYY干预:应用固相pH梯度(Immobilized pH gradient,IPG)2-DE技术分别分离正常组、GU模型组、GU模型复发组及JWYY组大鼠不同时间点胃组织总蛋白质后,经考染显色、PDquest图像分析、识别差异表达的蛋白质点,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laserdesorption/ionization time of flight mass,MALDI-TOF-MS)分析得到肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),再经Mascot软件搜索SWISS-PROT和NCBI蛋白质数据库鉴定蛋白质,并利用生物信息学资源对所鉴定蛋白质的功能进行分析。3.差异蛋白质HSP27(Heat Shock Protein 27)、GRP78(Glucose-RegulatedProtein 78)结果验证:为了验证蛋白质组学鉴定结果的可靠性,采用免疫组化、RT-PCR及Western blot方法对2个可能与GU复发及JWYY作用相关的差异蛋白质HSP27、GRP78于蛋白及mRNA水平的表达情况进行验证分析。
　　结果:1.GU复发大鼠模型的制备及JWYY干预:造模后第8d,经乙酸造模的各组大鼠胃黏膜肉眼观察和组织学检查均可见到溃疡病灶,但溃疡程度不一,GU模型组GUI最高,JWYY组GUI显著低于模型组(P<0.05)。至第92d,GU模型复发组、JWYY组溃疡复发率分别为90％,20%,后者与前者比较有显著性差异(P<0.01);2.GU复发大鼠胃组织的蛋白质组学研究及JWYY干预:①GU复发大鼠胃组织双向凝胶电泳图谱的建立及图像分析:建立了正常组、GU模型组、GU模型复发组及JWYY组大鼠胃组织的2-DE图谱。在相同的设定值时检测到的蛋白质点数分别为:正常组935±29个,GU模型组8d、92d分别为1012±23、1068±32个,GU模型复发组为1109±24个,JWYY组8d、92d分别为1002±43、1023±36个。经背景消减后,分别将其中的一块胶定为参考胶进行3块胶间的蛋白质点的匹配,结果得到正常组的平均匹配点数为867±31个,GU模型组8d、92d分别为957±28、989±42个,GU模型复发组为1007±35,JWYY组8d、92d分别为886±31、936±48个,其平均匹配百分率分别为92.7%、94.6%、92.6%、90.8%、88.4%、91.5%。不同胶蛋白质点在IEF方向的偏差为0.901±0.125 mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为1.108±0.102 mm;②各组大鼠胃组织2-DE图谱差异点分析:比较分析各组大鼠胃组织的2-DE图谱,GU模型组8d与正常组之间有282个差异点,65个在GU模型组表达上调,217个表达下调;JWYY组8d与GU模型组之间有216个差异点,157个在JWYY组表达上调,59个表达下调;GU模型复发组与正常组之间有189个差异点,73个在GU模型复发组表达上调,116个表达下调;JWYY组92d与GU模型复发组之间有168个差异点,115个在JWYY组表达上调,53个表达下调;③通过比较正常组、GU模型复发组及JWYY组双向凝胶电泳图谱的差异,发现并鉴定了15个可能与GU复发及JWYY干预相关的蛋白质,这些蛋白质的功能涉及分子伴侣、细胞骨架蛋白、物质代谢与转运、能量产生、抗氧化应激、信号转导及血液蛋白等。3.差异蛋白质HSP27、GRP78结果验证:免疫组化、RT-PCR及Western blot检测结果显示,HSP27、GRP78在正常胃组织中有少量表达,8d时GU模型组中表达明显增加(P<0.01),8d、92d时JWYY组中表达均明显增强(P<0.01),证实了正常组、GU模型复发组及JWYY组中HSP27、GRP78于蛋白、mRNA表达水平与2-DE结果相一致。
　　结论:1.JWYY能促进乙酸诱导的GU大鼠溃疡愈合,降低其GUI,改善溃疡愈合质量(QOUH),降低IL-1β诱导的GU复发大鼠的溃疡复发率;2.成功建立了正常组、GU模型复发组及JWYY组的双向凝胶电泳(2-DE)图谱,鉴定了15个差异表达的蛋白质,提示GU复发是一多种蛋白质参与的复杂过程,大鼠胃组织的比较蛋白质组学分析是筛选GU复发病变相关蛋白质的可靠方法之一;JWYY可调节GU复发大鼠胃组织的多种蛋白质表达,提示该复方具有多靶点的作用特点;3.HSP27、GRP78的免疫组化、RT-PCR及Western blot验证结果与蛋白质组学分析结果一致,从一定程度上证明了蛋白质组学实验方法的稳定性及其结果的准确性;同时也说明HSP27、GRP78于蛋白和基因转录水平表达基本保持一致;JWYY可能通过上调GU复发大鼠胃组织HSP27、GRP78蛋白和mRNA的上增性表达,从而实现抗溃疡复发,这可能是其抗GU复发的作用机制之一。

目录

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缩写词简表

技术路线

论文正文

前言

第一部分 胃溃疡复发大鼠模型的制备及健胃愈疡颗粒干预

1.材料与方法

2.结果

3.小结

第二部分 胃溃疡复发大鼠蛋白质组学研究及健胃愈疡颗粒干预

1.材料与方法

2.结果

3.小结

第三部分 差异蛋白质HSP27、GRP78结果验证

1.材料与方法

2.结果

3.小结

讨论

1 胃溃疡复发大鼠模型的制备及健胃愈疡颗粒干预

2 GU复发大鼠蛋白质组学研究及JWYY干预

3 JWYY对GU复发过程中差异蛋白质HSP72、GRP78表达的影响

4 JWYY抗PU复发的中医理论基础

结论

附表

附图

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要的研究成果