关于Runx2基因突变、表达调控和主要编码蛋白异构体功能差异的研究

摘要

背景：骨质疏松症是目前最影响人们生活质量的骨代谢性疾病之一，已证实骨质疏松的发病主要是成骨细胞生成减少，成骨过程活动相对减弱所致，而RUNX2是决定成骨细胞增殖分化及骨质生成的关键性转录因子。人Runx2基因多种形式的突变(包括缺失、插入、倒置突变等)与一种常染色体显性遗传病锁骨颅骨发育不全综合症(cleidocranial dysplasia，CCD)密切相关，表现为全身的软骨内成骨和膜内成骨障碍。Runx2基因在人体主要翻译表达二种蛋白异构体，Runx2-type Ⅰ(起始于P2启动子)和Runx2-typeⅡ(起始于P1启动子)，有研究显示二者N'端的氨基酸序列有差异，在体内翻译表达的时间及组织分布水平也有差异，但关于二者在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向成骨细胞分化过程中是否同样存在功能差异至今尚不明确。新近认为，植物雌激素可作为类雌激素的新型替代药物治疗妇女绝经后骨质疏松疾病，其中白黎芦醇/金雀异黄酮尤其具有良好的功效，但具体作用机制尚不明确，本文拟采用hBMSCs细胞模型，明确Runx2是否参与白黎芦醇/金雀异黄酮的促骨质生成效应并探索有关的信号转导通路。人骨髓间充质干细胞是一群具备多向分化潜能的间充质干细胞，在特定条件下可以向成骨细胞分化，是研究成骨细胞分化和骨质生成的重要模型，也是临床上治疗骨组织损伤的重要细胞来源，但原代hBMSCs在骨髓中含量极低且生命周期有限，因此建立永生化hBMSCs细胞株可为有关的研究提供丰富的细胞来源。 方法：(1)将猿猴病毒40大小T抗原稳定转入原代hBMSCs建立永生化人骨髓间充质干细胞系，检测细胞的生命周期，生长曲线及多向分化能力，并通过免疫染色方法鉴定细胞的表面标志。(2)采用hBMSCs为细胞模型，探索白黎芦醇/金雀异黄酮对其向成骨细胞分化的影响并查明可能参与的信号转导通路，检测向成骨细胞分化过程中Runx2及其下游基因Osterix、Osteocalcin mRNA表达水平的变化(Real-Time PCR方法)、成骨特异性指标ALP活性和细胞外钙沉积量表达水平的变化、MAPK通路蛋白pp44/42和pp38表达水平的变化(Westem blotting方法)。(3)通过逆转录病毒载体介导的RNAi方法建立稳定只表达单个RUNX2蛋白异构体的永生化hBMSCs细胞株，检测Runx2-type Ⅰ和Runx2-type Ⅱ在hBMSCs向成骨细胞分化过程中mRNA表达水平的差异(Real-Time PCR方法)，并同步检测多项成骨特异性指标如ALP活性、细胞外钙沉积量、骨钙基因启动子表达水平的变化。(4)对临床收集的3个中国CCD家系的患者，提取基因组DNA后利用聚合酶链式反应(PCR)扩增Runx2基因的所有外显子及P1、P2启动子序列，通过直接测序比对的方法探明是否存在突变，并对检测到的突变在体外进行有关的功能学研究。 结果：(1)建立了永生化人骨髓间充质干细胞株，并证实其在保留了正常的细胞形态、生长曲线、细胞表面标志和多向分化潜能的同时，获得了无限繁殖的生命力；(2)促成骨细胞分化条件下，白黎芦醇可显著上调Runx2及其下游基因Osterix、Osteocalcin的表达，且白黎芦醇/金雀异黄酮均可刺激MAPK通路磷酸化p44/42和p38的表达显著增加，p44/42MAPK通路抑制剂PD98059可削弱白黎芦醇的促成骨细胞分化效应，而p38MAPK通路抑制剂SB203580可削弱金雀异黄酮的促成骨细胞分化效应。此外雌激素受体抑制剂ICI182780也可显著降低白黎芦醇/金雀异黄酮的促成骨细胞分化效应；(3)Real-timePCR检测结果显示Runx2-type Ⅰ主要在促成骨细胞分化早期起作用，可能与细胞增殖有关，Runx2-type Ⅱ主要在促成骨细胞分化晚期起作用，可能与细胞分化成熟有关；ALP活性、细胞外钙沉积量和骨钙基因启动子表达水平的检测结果进一步显示Runx2-typeⅡ在促成骨细胞分化过程中的作用较Runx2-typeⅠ重要，尤其在促成骨细胞分化晚期；(4)在中国CCD家系中探得Runx2基因的2个单碱基突变，包括1个报道过的错义突变(577C>T)和1个新的无义突变(240G>A)。体外研究证实，577C>T突变使RUNX2蛋白193位的精氨酸替换为中止密码子(R255X)，产生截短的RUNX2蛋白(64：KD→30 KD)，并丧失对骨钙基因启动子的激活潜能。 结论：(1)成功构建了永生化人骨髓间充质干细胞株模型，从根本上解决了原代细胞短缺和老化问题，并能够长期地为有关的研究提供丰富的同源性细胞来源；(2)证实了植物雌激素白黎芦醇/金雀异黄酮对hBMSCs向成骨细胞分化有促进作用，且白黎芦醇可通过刺激Runx2等成骨基因的表达及激活ER-p44/42MAPK通路产生促成骨细胞分化效应，而金雀异黄酮可通过ER-p38MAPK通路实现这一效应，这为指导临床用药防治骨质疏松类疾病拓开新的思路；(3)首次应用逆转录病毒载体介导的RNAi方法建立稳定只表达单个RUNX2蛋白异构体的永生化hBMSCs细胞株；(4)向国内外首次提供有关Runx2-type Ⅰ和Runx2-type Ⅱ蛋白异构体在hBMSCs向成骨细胞分化过程中存在作用差异的直接实验证据，有关研究对于开发新药调控RUNX2各蛋白异构体的表达及治疗骨质疏松类疾病具有潜在的价值；(5)通过突变检测证实Runx2基因是中国家族性CCD患者的致病基因，并通过体外研究证实了Runx2基因突变是导致该病临床表型的原因。突变检测的结果可用于CCD家系后代的产前诊断，并扩充了在世界范围内中国CCD患者的Runx2基因突变资料。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词简表

声明

第一章通过稳定转染猿猴病毒大小T抗原方法建立永生化人骨髓间充质干细胞株

摘要

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论与结论

第二章细胞水平研究植物雌激素(白黎芦醇/金雀异黄酮)对Runx2表达的调控并探索可能的信号转导通路

摘要

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论与结论

第三章RNA干扰技术研究Runx2主要蛋白异构体(Runx2-typeⅠ、Runx2-type Ⅱ)在hBMSCs向成骨细胞分化过程中的功能差异

摘要

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.论与结论

小结

第四章中国人群中锁骨颅骨发育不全综合症(CCD)患者的Runx2基因突变现象

摘要

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论与结论

参考文献

综述一 Runx2基因调控及其异构体的最新研究进展

致谢

攻读学位期间主要成果