利用激光捕获显微切割及基因芯片技术构建喉鳞状细胞癌基因组差异表达谱

摘要

研究目的： 喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，占头颈部肿瘤的第二位，喉癌原发于声带部位者居多，约占60％。因为不同患者所患喉癌在病理类型、肿瘤分化程度、就诊时病变严重程度等方面有差异，因此不同喉癌患者具有不同的临床表现及体征，对手术后放疗、化疗的敏感性各有差异，所以如何找到早期诊断，疗效监测的分子标志物，将为实现对喉癌的个性化治疗奠定理论基础。目前，国内喉癌标志物的研究主要集中在喉癌相关的单个基因功能研究，难以从整体上把握喉癌相关蛋白或基因的变化，更未将显微切割、组织纯化技术引入到喉癌研究中，因此，使用高通量基因芯片、结合显微切割、线性扩增技术，构建并研究不同临床分期的喉癌组织中癌细胞的差异基因表达谱，对临床筛选不同用途的分子标记物具有重要的指导意义。 研究方法： (1)建立喉癌组织标本库及喉癌临床资料数据库，筛选严格配对的8例喉癌组织及相对应的癌旁正常的粘膜组织进行研究。 (2)通过RNA保护以克服组织中RNA降解，应用激光捕获显微切割技术以获得纯净的癌细胞和纯净的正常喉粘膜上皮细胞，体外线性扩增以解决RNA量少的问题，结合人类全基因组寡核苷酸芯片HG-U133.Plus.2.0芯片，构建了16例纯化喉组织全基因组表达谱。 (3)对部分特异性候选靶基因进行qRT-PCR,检测基因的表达情况(4)从喉癌标本组织库中筛选50对标本，即50例喉癌组织和相对应的癌旁正常的粘膜组织，制作成组织芯片，对部分基因进行验证。 研究结果： (1)通过SAM等软件分析，将8对喉癌与癌旁正常组织表达谱依次进行比较，筛选出差异基因2351个；将8对喉癌与癌旁正常组织表达谱进行比较，再将早期癌与晚期癌进行比较处理，筛选出差异基因761个。 (2)对筛选出的基因进行GO分类，主要分为3大类：一、细胞组成为31.96％；二、分子功能为35.26％；三、生物学过程为32.78％。细胞定位分析发现：这些靶基因分别作用于细胞核、核膜，细胞浆及胞膜等部位，参与离子转运、信号传导、细胞凋亡、多种酶活性、核酸结合、核酸合成、修饰等功能过程。 (3)对筛选出的基因进行信号通路(pathway)分析，筛选主要的信号通路为：细胞周期，以整合素介导的细胞粘附，基质金属蛋白酶，Wnt信号传导,炎症反应通路，TGF-β通路等主要的信号通路。 (4)对部分特异性候选靶基因进行qRT-PCR试验，基因MMP12，KRT16，KRT19，HMGA2，在喉癌组织中均表现为上调，在正常的喉粘膜上皮中表达较弱或不表达。基因KRT23，RARB，PRB1则在喉癌组织中均表现为下调。上述结果与基因芯片表达的结果是一致的。 (5)制作100例标本的组织芯片，对候选靶基因MMP12，HMGA2，RARB进行检测，结果显示：MMP12，HMGA2蛋白在喉癌组织中均出现显著的高表达，而RARB蛋白在喉癌组织中则出现低表达，三种蛋白的异常表达提示其在喉癌的发生发展中可能发挥重要作用。 研究结论： (1)通过RNA保护、激光捕获显微切割、微量RNA提取及线性扩增等技术，结合全基因组寡核苷酸芯片技术，首次成功构建了喉部纯化组织差异基因组表达谱。 (2)喉癌基因表达谱实验结果显示：细胞周期，以整合素介导的细胞粘附，基质金属蛋白酶为喉癌主要的三大信号通路，为临床寻找喉癌早期诊断、疗效监测等方面的分子标记物提供非常有力的理论基础。 (3)通过qRT-PCR和组织芯片大样本实验对部分候选靶基因的检测发现基因的表达结果和基因表达谱中的结果是一致的，进一步佐证了基因表达谱的可靠性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语对照表

声明

前言

实验流程图

第一部分喉癌标本的收集和保存

1.1组织保存试剂

1.2组织标本采集

1.3 RNAlater RNA Stabilization Reagent特点

1.4收集临床资料，建立标本档案

第二部分喉部组织标本的纯化

2.1技术路线

2.2材料

2.3方法

第三部分纯化组织中微量RNA提取

3.1材料

3.2提取纯化组织中RNA

3.3 RNA质量检测

第四部分线性扩增，构建基因表达谱

4..1材料

4.2方法

4.3结果

第五部分对数据进行统计学分析，筛选差异表达基因

5.1统计学软件

5.2分析流程

5.3分析方法

5.4将GCOS.4软件读取的芯片数据输入SAM等软件，筛选与喉癌各种临床性状相关的分子标记物

5.5差异基因结果综合分析

第六部分对喉癌基因表达谱进行验证

6.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

6.2组织芯片

第七部分讨论

结论

参考文献

文献综述：基因芯片技术在肿瘤研究中的应用

致谢

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