牛磺酸通过ERK途径抑制血管平滑肌细胞向成骨细胞分化

摘要

目的：为了了解牛磺酸在血管钙化过程中的可能发挥的作用，通过体外研究的方法来测定它在血管平滑肌(vascular smooth muscle cells，VSMCs)向成骨细胞分化过程中的影响。 方法：大鼠VSMCs根据Campbell[13]所描述的植块法所获得，并放入适当的培养基及环境中培养，待VSMCs长到适于干预的程度，将其置于加入β-甘油磷酸钠的钙化培养基中，并用不同浓度牛磺酸进行干预指定时间。细胞的钙含量通过用原子吸收光谱测定，VSMCs的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性用荧光分光光度计法测定细胞在37℃下对硝基苯酚的释放量来确定，细胞裂解液和核提取物的蛋白含量用Bradford蛋白法及Western免疫印迹化学发光法测定。为了探讨牛磺酸对VSMCs作用的信号转导通路，我们还利用牛磺酸及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)阻断剂PD98059共同干预VSMCs，并在12天后测定钙的沉积和ALP活性，核结合因子α1(core binding factor α1，Cbfα1)则在6天后测定。实验结果用总蛋白水平作为衡量标准，数据用平均值加减标准差的形式来记录下来。然后用差异分析法来比较多于两组数值之间的异同(one-way ANOVA)。P值小于0.05我们就认为所有的数据具有统计学意义。 结果： 1.牛磺酸对培养的VSMCs ALP活性的作用存在剂量依赖效应和时间依赖效应。在孵育12天后，相对于未钙化组，钙化组VSMC的ALP活性明显增加，而牛磺酸本身对ALP活性并没有作用。 2.牛磺酸对VSMCs钙沉积的作用与其对ALP活性的作用是平行的。即牛磺酸对VSMCs钙沉积作用也存在剂量依赖效应和时间依赖效应。 3.在β-甘油磷酸钠介导的VSMCs钙化过程中，牛磺酸抑制Cbfα1.的表达作用存在着剂量依赖效应。 4.牛磺酸可以刺激特异ERK活性。 5.ERK阻断剂PD98059可以阻断牛磺酸降低钙化VSMCs ALP活性、钙沉积以及Cbfα1的表达的作用。 结论：牛磺酸可以抑制β-甘油磷酸钠介导的VSMCs向成骨细胞分化。ALP活性的下降以及Cbfa-1表达的下降都可证明这一点。牛磺酸还可以激活ERK通路。抑制ERK转导通路可以阻断牛磺酸对ALP激活和对Cbfa1表达的作用。这些结果都表明牛磺酸可以通过ERK途径抑制血管平滑肌细胞向成骨细胞分化。

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文摘

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论文说明：缩略词一览表

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第一章前言

第二章材料和方法

2.1细胞培养

2.2钙沉积的定量

2.3碱性磷酸酶活性的分析

2.4蛋白裂解液的准备和免疫印迹

2.5牛磺酸减少VSMCs向成骨细胞分化的信号通路

2.6统计

第三章结果

3.1牛磺酸对降低培养的VSMCs碱性磷酸酶(ALP)活性的作用存在剂量依赖效应和时间依赖效应

3.2牛磺酸对VSMCs钙沉积的作用与其对ALP活性的作用是平行的,即牛磺酸对减少VSMCs的钙沉积作用也存在剂量依赖效应和时间依赖效应

3.3在β-甘油磷酸钠介导的VSMCs钙化过程中，牛磺酸抑制Cbfα1的表达作用存在着剂量依赖效应

3.4牛磺酸可以刺激特异ERK活性

3.5 ERK抑制剂PD98059可以阻断牛磺酸降低钙化VSMCs ALP活性、钙沉积以及Cbfα1的表达的作用

第四章讨论

第五章结论

参考文献

综述 脂肪细胞因子在骨代谢中的进展

致谢