核仁素对LPS所致炎症因子IL-1β释放的影响

摘要

脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS)，常并发于严重创伤、烧伤、休克和外科大手术后，由其诱发的多器官功能障碍综合征(MODS)已成为当今外科患者的重要死亡原因。虽然脓毒症的发生机制尚未完全阐明，但是革兰氏阴性细菌胞壁上的脂多糖(LPS)即内毒素启动体内免疫系统在脓毒症发病中的重要性已受到广泛关注。 核仁素(nucleolin)又称C23，是真核细胞核仁中最主要的一种磷酸蛋白质。其主要功能参与核糖体rRNA的转录、核糖体亚单位组装、成熟等功能。近年研究发现，核仁素在丙型肝炎病毒复制、人类免疫缺陷病毒与人副流感病毒感染宿主细胞、基因转录调控等过程中也发挥了重要作用。然而，核仁素在炎症反应中是否具有及具有何种作用，目前尚不清楚。 本研究拟初步探讨核仁素在脂多糖(LPS)所致炎症反应中的作用。采用大肠杆菌LPS处理RAW264.7小鼠巨噬细胞株以建立细胞炎症模型，采用Western-blot观察核仁素在LPS所致细胞炎症反应中的表达改变；采用LPS(15mg/kg)经腹腔注射小鼠复制小鼠内毒素血症模型，分别于注射LPS后6h、12h、24h提取肺组织总蛋白，用Western Blot检测不同时间点核仁素的表达改变。进一步采用RAW264.7小鼠巨噬细胞通过瞬时转染C23反义寡核苷酸和真核表达质粒(pcDNA3.1-C23)，经ELISA检测LPS处理后不同时间点炎症因子IL-1β的表达改变，探讨核仁素在LPS所致炎症反应中的作用。 主要结果如下： 1.用500ng/ml的LPS处理RAW264.7细胞后，核仁素表现为两条带：其一分子量约为110kD，其二分子量约为80kD；与未处理组比较，110kD核仁素区带在经LPS处理6h后表达上调，12h上调最明显并维持到36h；而80kD区带在LPS处理后逐渐减少。 2.用LPS(15mg/kg)经腹腔注射小鼠后，小鼠肺组织中核仁素显示出两条带，其一分子量约为110kD，其二分子量约为80kD；与正常组相比，110kD核仁素于LPS注射6h后开始表达上调，12h达到最高并维持到24h；80kD的核仁素则于注射LPS 6h后表达下调。 3.用含核仁素全长基因的真核表达载体(pcDNh3.1-C23)瞬时转染PAW264.7细胞，发现核仁素过表达组LPS所致的IL-1β释放较转空载体组明显增加。 4.采用核仁素反义寡核苷酸瞬时转染RAW264.7细胞，发现核仁素低表达组LPS所致的IL-1β释放则较正常细胞组和随机寡核苷酸组明显下降。 结论： (1)LPS所导致的RAW264.7巨噬细胞炎症模型及小鼠整体动物内毒素血症模型中，C23110 kD的片断明显上调，而80kD的片断下调。 (2)C23低表达抑制LPS所致IL-1β的释放，而C23过表达促进LPS所致IL-1β的释放。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写注释

声明

第一章前言

第二章技术路线

1. 观察LPS对整体小鼠肺组织及RAW264.7小鼠巨噬细胞中核仁素表达的影响

2.探讨核仁素在LPS所致IL-1β释放的影响

第三章材料与方法

1.材料：

1.1.细胞系

1.2.抗体

1.3.试剂盒

1.4.其他主要试剂

1.5.主要仪器

2.方法

2.1细胞株传代培养

2.2 pcDNA3.1-C23真核表达载体的构建及鉴定

2.3 C23反义寡核苷酸的设计

2.4 DNA定量

2.5 pcDNA3.1-C23，反义寡核苷酸瞬时转染RAW264.7细胞

2.6免疫印迹

2.7 Western blot条带的灰度扫描及其定量分析

2.8酶联免疫吸附实验(ELISA)

2.9统计分析

第四章实验结果

1LPS所致小鼠以及巨噬细胞炎症模型中核仁素表达的变化

1.1Balb/c小鼠内毒素血症模型中核仁素表达的变化

1.2核仁素在RAW264.7细胞炎症模型中的表达改变

2用生物信息学方法筛选可能受核仁素调控的炎症介质基因

3探讨核仁素过表达对LPS所致IL-1β释放的影响

3.1转核仁素真核表达载体后RAW264.7细胞中核仁素的表达改变

3.2核仁素过表达对LPS所致RAW264.7细胞IL-1β释放的影响

4探讨核仁素低表达对LPS所致IL-1β释放的影响

4.1核仁素反义寡核苷酸对RAW264.7细胞核仁素表达的影响

4.2核仁素低表达对LPS所致RAW264.7细胞IL-1β释放的影响

第五章分析与讨论

第六章结论

参考文献

综述 核仁素功能的最新研究进展

致谢