DNA甲基化对LRP1表达的影响及其在冠心病发病机制中作用的实验研究

摘要

动脉粥样硬化(AS)是威胁人类健康的重要疾病，与其相关的心脑血管疾病在发达国家和我国占死亡率第一位。AS血管病变斑块的产生和进展是由于血管壁细胞吞噬胆固醇脂并导致其在细胞内的堆积所致，在该过程中低密度脂蛋白受体家族(LDLRs)中的多种受体发挥了重要作用，其中(LRPl)尤其受到重视。早期的研究发现LRRl内吞是胆固醇脂进入细胞的重要途径，且不受细胞内脂质浓度的调节，因此LRRl一直被认为是动脉粥样硬化中泡沫细胞形成的重要因素之一，其本身可能起促进动脉粥样硬化进展的作用。但是近来的研究发现，巨噬细胞LRPl功能缺陷小鼠的动脉粥样硬化病变反而更加严重，推测LRPl在动脉粥样硬化病程中可能有保护作用，而这和早期少量样本研究中发现的冠心病患者单核细胞可能高表达LRRl相矛盾，目前资料还难以清楚解释这种现象。新近在对肿瘤患者的研究中发现DNA甲基化可能参与LRRl基因表达调节的线索，但是其在动脉粥样硬化的发病机制中的作用目前尚不清楚，本课题就此展开研究。 目的： 通过较大样本观察正常人和冠心病患者单核细胞LRPl的表达情况，并在不同年龄段进行亚组分析，着重观察分析不同年龄段冠心病患者和正常人LRPl表达的差异；研究正常人和冠心病患者单核细胞LRRl基因启动子区域附近基因甲基化情况，分析其是否影响LRRl的基因表达。在体外培养的单核细胞和人血管平滑肌细胞中，给予DNA甲基化抑制剂5一脱氧杂氮胞苷改变其DNA甲基化状态，观察其是否影响LRPl的表达，并进一步观察DNA甲基化状态不同是否影响细胞的生物学行为特征。 方法： 采用横断面研究方法，分别收集110位不同年龄段正常体检志愿者、112例冠心病患者外周血单核细胞，采用RT-PCR方法检测LRPl的mRNA的表达情况，采用蛋白印迹法测定LRPl蛋白浓度；并从外周血白细胞中提取基因组DNA，采用亚硫酸氢钠测序方法检测LRPl基因启动子区域甲基化水平，并对结果进行统计学分析，比较不同组间是否存在差异，以及年龄和基因甲基化水平、LRRl的表达情况是否存在相关。体外培养单核细胞和血管平滑肌细胞，给予DNA甲基化抑制剂5.脱氧杂氮胞苷，并分别给予不同细胞因子刺激干预后收集细胞测定LRRl蛋白表达，RT-PCR检测LRRl的表达情况，采用台盼兰染色活细胞计数、四唑盐(MTT)比色法观察细胞的增殖，刮伤实验模型法检测细胞的迁移并对检测结果进行统计学分析。 结果： 在年龄<50岁的冠心病患者中，LRPl的mRNA表达和蛋白质表达处于较高水平，其基因的甲基化状态和同年龄段正常人相比无显著差异；年龄>50岁的冠心病患者和正常同龄对照组相比，L,RPl的表达差异消失，其mRNA和蛋白表达均处于相同水平，该年龄段正常人和冠心病患者的L,RPl基因的DNA甲基化水平均有升高，而冠心病患者的I,RPl基因启动子区域附近的DNA甲基化水平升高更加明显，有统计学差异。体外培养的细胞学研究中发现：5-脱氧杂氮胞苷干预会影响单核细胞和血管平滑肌细胞LRRl的mRNA和蛋白表达，干预后其表达水平升高：5-脱氧杂氮胞苷干预的血管平滑肌细胞生物学行为特性改变，其血小板源性生长因子诱导的细胞增殖、迁移受到抑制。 结论： 1.LRRl在早发冠心病患者(年龄<50岁)中高表达，但是在50岁以上年龄患者中这种差异消失。这种改变可能导致了LRRl在冠心病的不同阶段发挥不同作用，由早期的代偿性保护作用转变为促动脉粥样硬化进展的作用。50岁以上冠心病患者LRPl的基因启动子附近区域的DNA甲基化状态升高可能是导致LRPl表达降低的机制之一。 2.单核细胞和血管平滑肌细胞LRRl基因的DNA甲基化水平降低，会导致基因的高表达。基因的DNA甲基化水平下降，对其他外源性基因调控机制可能存在允许或增强机制。 3.血管平滑肌细胞LRRl基因的DNA甲基化水平降低，能对抗PDGF诱导的平滑肌细胞的增殖和迁移作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分冠心病患者外周血单核细胞LRP1基因DNA甲基化水平的变化和意义

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分DNA甲基化状态修饰和转化生长因子对单核细胞表达LRP1的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第三部分DNA甲基化修饰对血管平滑肌细胞LRP1的表达及其对细胞增殖的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述一：低密度脂蛋白受体相关蛋白和动脉粥样硬化关系研究进展

综述二：DNA甲基化修饰和动脉粥样硬化的研究进展

附录一 LRP的基因全序列

致谢

攻读博士学位期间主要发表的论文