代谢因子对胰岛和下丘脑内分泌相关电生理反应的影响

摘要

内分泌细胞及神经内分泌细胞是机体内一类主要可兴奋性细胞，其生理功能为分泌相关激素或神经递质。各种类型分泌细胞在接受刺激产生分泌活动前，均表现出膜电位、电阻等一系列电信号的改变。因此，揭示分泌细胞电生理特性的研究对于探讨其细胞内分泌调控机制显得尤为重要。机体内分泌系统和神经内分泌系统受多种代谢因子的调节，如碳水化合物，氨基酸及脂肪酸以及多种代谢相关因子（如Leptin，Adiponectin，Ghrelin，Obestatin）等。为探讨机体代谢相关因子对内分泌及神经内分泌细胞电生理特性和分泌活动的影响，本研究选择经典内分泌细胞胰腺β细胞为代表，研究了物质代谢中脂肪酸对细胞电生理特性及分泌功能的影响，探讨脂肪酸直接影响β细胞的机制；选择经典生长轴的生长激素细胞，研究了新近发现的胃肠激素Ghrelin及Obestatin对生长素细胞的上层调控神经内分泌细胞--GHRH神经元的电生理特性及其功能的影响，探讨机体代谢因子Ghrlein对生长激素分泌的间接调控的机制。 本文共分为三章。在第1章和2章，采用原代培养的大鼠胰腺β细胞，研究了脂肪酸对胰腺β细胞电生理特性的影响及其机制。第3章采用eGFP-GHRH转基因小鼠，在新鲜制备的下丘脑脑片上检测Ghrelin及Obestatin对小鼠GHRH细胞在完整神经网络中突触反应的影响。 第一章长链脂肪酸对大鼠胰腺β细胞上电压依赖性钾电流的影响1.采用制霉菌素穿孔的全细胞电流记录方法，检测到长链脂肪酸可显著性减小IK电流，并引起此电流的快速失活，另外，时间曲线显示此效应为可逆性。 2.采用RT-PCR方法检测到GPR40mRNA在大鼠胰岛组织、MIN6小鼠β细胞株和INS-1大鼠β细胞株上均有高水平GPR40mRNA的表达。 3.采用GPR40特异性siRNA下调MIN6细胞GPR40mRNA的表达后，细胞的电压依赖性钾电流无明显改变，但亚油酸诱导的电压依赖性钾电流降低效应则被显著抑制。给予受体后分子信号的激动剂，即膜通透性cAMP的激动剂，8-bromo-cAMP，在正常MIN6细胞和siRNA-GPR40处理后MIN6细胞上，均可观察到类似亚油酸诱导的钾电流抑制效应。 4.ELISA检测结果显示，亚油酸呈浓度依赖性增加MIN6β细胞株胰岛素的分泌。而相同浓度的甲基亚油酸盐并不影响胰岛素分泌及亚油酸的促胰岛素分泌效应。 结论：①亚油酸通过与细胞膜上GPR40受体结合，显著降低大鼠胰腺β细胞上电压依赖性钾电流并加快其失活。②亚油酸的快速效应可引起胰腺β细胞内钙离子浓度增高，胰岛素释放显著增加。 第二章亚油酸对大鼠胰腺β细胞上电压依赖性钙电流的影响1.制霉菌素穿孔全细胞电流记录法，记录体外原代培养大鼠胰腺β细胞上VDCC电流，细胞外液中加入亚油酸可逆性引起VDCC电流的显著降低。 2.与GPR40无结合效应的甲基亚油酸盐对大鼠胰腺β细胞VDCC电流无任何影响，而在此基础上，再给予亚油酸，可观察到同样的VDCC电流降低。 3.亚油酸降低胰腺β细胞上VDCC电流的信号传导途径研究显示，PKC和PKA阻断剂的存在并不影响大鼠胰腺β细胞上的VDCC电流以及亚油酸降低钙电流的效应。Thapsigargin预培养30分钟，可阻断亚油酸诱导的细胞膜上VDCC电流的改变。 4.[Ca2+]测定试验显示，β细胞内钙浓度的基础水平不受Thapsigargin的影响；亚油酸显著增高[Ca2+]i，而甲基亚油酸并不影响细胞内钙离子浓度的改变。 5.肪酸与GPR40结合，可激活细胞内PLC-IP3途径，继而增加细胞内钙的释放。采用PLC阻断剂U73122可完全阻断亚油酸降低β细胞VDCC电流的效应，同时，亚油酸在β细胞上引起的一过性[Ca2+]i增高也被完全消除。 结论：亚油酸刺激细胞内钙释放，通过钙诱导的VDCC失活显著降低大鼠胰腺β细胞上电压依赖性钙电流。 第三章Ghrelin和Obestatin对GFP-GHRH转基因小鼠GHRH神经元Glutamatergic及GABAergic突触反应的影响1.Ghrelin及obestatin对GHRH神经元eEPSCs的影响，试验分别检测了16和19个神经元，结果显示，1μMGhrelin和Obestatin均不影响GHRH神经元上的eEPSCs。 2.Ghrelin对GHRH神经元eIPSCs的影响，在记录的49个细胞中，26个细胞（约53.06％）的eIPSCs在Ghrelin处理后，较对照电流明显降低，余24个神经元对Ghrelin并不敏感。另外，Ghrelin对eIPSCs的降低效应呈剂量依赖性。 3.GHSR-1A特异性拮抗剂BIM28163对eIPSCs无影响，但可完全阻断Ghrelin对GHRH细胞eIPSCs的抑制效应。 4.Obestatin不影响GHRH神经元的eIPSCs，但可完全阻断Ghrelin对GHRH细胞eIPSCs的抑制效应。 5.为了排除GHRH神经元本身对Ghrelin不敏感的可能性，也采用了先给予Ghrelin，然后Ghrelin与Obestatin联合给药的方式，在6个记录的GHRH神经元中，均观察到Obestatin对Ghrelin的拮抗效应。另外，相同条件下Ghrelin双次给药均可引起GHRH神经元上eIPSCs电流降低的结果用以排除受体失活导致假阳性结果的可能性。 6.放射免疫法测定小鼠下丘脑脑片培养液中GHRH含量，Ghrlein对基础水平GHRH的释放无影响，但可在28mMKCl协同作用下刺激GHRH的释放。 结论：①Ghrelin对GHRH细胞的兴奋性神经递质突触反应无影响，但显著降低GHRH细胞对抑制性神经递质的突触反应，提示Ghrelin可参与调节GHRH神经元兴奋性的增加；②Obestatin阻断Ghrelin对GHRH神经元eIPSCs的抑制效应提示Obestatin阻断Ghrelin促GH分泌的机制发生在下丘脑水平；③Ghrlein对基础水平GHRH的释放无影响，但在KCl协同作用下刺激GHRH释放，提示其在GHRH分泌释放中的调节作用。 综上所述，本研究首次阐明了长链脂肪酸通过与细胞膜上特异性受体结合，对胰腺β细胞电压依赖性K+电流及Ca2+电流产生影响，并刺激胰岛素的分泌，为糖尿病的临床治疗提供新的思路。另外，本研究利用eGFP-GHRH转基因小鼠，首次在下丘脑片上观察到Ghrelin对GHRH单个细胞电生理特性的影响以及Obestatin对Ghrelin增加GHRH兴奋性的拮抗效应。并首次在小鼠下丘脑片上证实Ghrelin可促进GHRH的释放，为Ghrelin刺激GH分泌的下丘脑机制提供了直接证据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

总前言

第一章脂肪酸对大鼠胰腺β细胞上电压依赖性钾电流的影响

1.1前言

1.2材料与方法

1.3结果

1.3.1长链脂肪酸降低大鼠胰腺B细胞上电压依赖性钾电流

1.3.2 GPR40 mRNA在胰岛和胰腺B细胞株上的表达

1.3.3 GPR40特异性siRNA阻断MIN6细胞上GPR40受体表达

1.3.4 siRNA阻断MIN6细胞上GPR40受体表达后对亚油酸诱导钾电流抑制效应的影响

1.3.5亚油酸增加MIN6细胞胰岛素的分泌

1.4讨论

1.5小结

第二章亚油酸对大鼠胰腺β细胞上电压依赖性钙电流的影响

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果

2.3.1亚油酸降低大鼠胰腺β细胞上电压依赖性钙电流(VDCC电流)

2.3.2甲基亚油酸不影响VDCC电流以及亚油酸降低VDCC电流的效应

2.3.3细胞内PKC和PKA途径均不参与亚油酸降低VDCC电流的机制

2.3.4 Thapsigargin处理细胞阻断亚油酸降低VDCC电流的效应

2.3.5 Thapsigargin处理细胞阻断亚油酸诱导的一过性[Ca2+]i的增加

2.3.6甲基亚油酸不影响细胞内钙离子浓度及亚油酸诱导的[Ca2+]i增加

2.3.7 U73122阻断亚油酸诱导的β细胞上VDCC电流降低和一过性[Ca2+]i增加

2.4讨论

2.5小结

第三章 Ghrelin和Obestatin对GFP-GHRH转基因小鼠GHRH神经元Glutamatergic及GABAergic突触反应的影响

3.1前言

3.2材料与方法

3.3结果

3.3.1 GHRH神经元电生理记录后的组织学定位鉴定及GHSR-1A在GHRH神经元上的表达

3.3.2 GHRH神经元上谷氨酸(Glutamate)和γ-氨基丁酸(GABA)突触反应的电生理定性

3.3.3 Ghrelin与Obestatin对GHRH神经元上电刺激诱发谷氨酸兴奋性突触电流的影响

3.3.4 Ghrelin对GHRH神经元上电刺激诱发γ-氨基丁酸抑制性突触电流的影响

3.3.5 Ghrelin对GHRH神经元上elPSCs影响机制

3.3.6 Obestatin对GHRH神经元上eIPSCs的影响及其对Ghrelin的拮抗效应

3.3.7 Ghrelin对下丘脑释放GHRH的影响

3.4讨论

3.5小结

总结论

参考文献

综述一 胰岛素分泌β细胞上的离子通道

综述二 Ghrelin与Obestatin：一对胃肠刺激素的结构与功能

致 谢

攻读博士学位期间主要研究成果