腺苷信号通路在阴茎异常勃起及纤维化中的作用机理研究

摘要

阴茎异常勃起(Priapism)是指在没有性刺激的情况下，阴茎持续勃起超过4小时的病理状况。尽管它在普通人群并不常见，但在某些特殊人群中有很高的发病率。早在1934年，人们就意识到阴茎异常勃起是镰刀状红细胞贫血症(Sickle Cell Disease,SCD)的主要并发症之一，40％的该类患者表现阴茎异常勃起。
　　 阴茎异常勃起是泌尿男科的急症之一，如不及时采取有效的治疗措施，会引起阴茎组织的损伤坏死、海绵体纤维化，最终导致勃起功能障碍(Erectile Dysfunction,ED)。然而，由于目前该病发生的病理生理机制不详，临床上尚缺乏针对发病机理的有效治疗手段。很多患者不得不接受外科手术治疗，术后往往无法恢复正常的勃起功能。
　　 我们前期的研究意外地发现腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase,ADA)基因缺陷小鼠表现出阴茎异常勃起。ADA是腺苷代谢过程中极其重要的酶类，它能催化腺苷转变为次黄嘌呤核苷，该基因缺陷的小鼠表现出全身组织、器官的高腺苷水平，尤其是阴茎组织，腺苷浓度远高于其他被测组织。研究表明该小鼠阴茎组织中过高的腺苷浓度通过A2B腺苷受体导致阴茎海绵体平滑肌过度舒张而引起阴茎异常勃起。该发现在镰刀状红细胞贫血症转基因小鼠（Sickle Cell Disease Transgenic Mouse,SCD Tg小鼠）中得到了进一步地证实，SCD Tg小鼠是目前公认和广泛使用的阴茎异常勃起动物模型，其阴茎组织中腺苷水平升高也是导致阴茎异常勃起的原因。因此，我们在两种独立的动物模型中证实腺苷信号通路在阴茎异常勃起的发生中发挥极其重要的作用，也暗示该通路可成为治疗阴茎异常勃起的靶点。
　　 阴茎纤维化的发生源自于阴茎持续勃起、局部组织缺血缺氧、阴茎组织损伤坏死以及组织修复等一系列病理反应，许多生物因子及炎症介质参与了这一过程。目前，阴茎纤维化的分子机制尚未完全明了。学术界已公认缺血缺氧的微环境会导致腺苷的大量产生，已有的研究表明过高的腺苷水平会通过腺苷受体激活纤维化通路导致肝脏、肺组织的纤维化。因此，我们推测阴茎异常勃起引起的缺血缺氧可导致阴茎组织中的腺苷水平增高，后者可通过其受体介导阴茎纤维化的发生。
　　 第一部分：ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠模型的维持及基因型鉴定
　　 目前已证实ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠均为阴茎异常勃起的动物模型，本研究利用了这两种模型深入探讨腺苷信号通路在阴茎异常勃起及纤维化中的作用机制。
　　 ADA基因缺陷小鼠被人为敲除了ADA基因，表现出与先天性ADA缺陷症患者极其相似的特征，包括淋巴细胞减少、重症联合免疫缺陷(Severe Combined Immunodeficiency Disease,SCID)、骨骼发育异常、肺功能缺陷等等，如不予ADA替代治疗，小鼠通常在出生后数周内死于免疫缺陷。先天性ADA缺陷症患者能依赖聚乙二醇腺苷脱氨酶(Polyethylene Glycol-modified Adenosine Deaminase,PEG-ADA)替代治疗而长期生存。因此，我们也常规给予ADA基因缺陷小鼠PEG-ADA治疗以维持小鼠体内正常的腺苷水平，ADA基因缺陷小鼠亦可依赖此治疗而长期生存。ADA基冈缺陷小鼠出生后，50％为ADA纯合子小鼠，50％为ADA杂合子小鼠。因此，小鼠出生后第5天，我们常规行酶谱分析检测ADA的活性以鉴定小鼠的基因型，该法对小鼠基因型鉴定的准确率为100％。
　　 SCD Tg小鼠表达与SCD病人相同的血红蛋白(HbS，α2βS2)，几乎具备SCD所有的特征，包括红细胞不可逆地镰状化、贫血、多器官病理损伤、阴茎异常勃起等等。该小鼠出生后50％为SCD Tg纯合子小鼠，50％为SCD Tg杂合子小鼠。因此，小鼠出生后6周，我们需采用血涂片检查和PCR鉴定两种方法鉴定小鼠的基因型。
　　 第二部分：腺苷脱氨酶能有效地预防和治疗ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠的阴茎异常勃起
　　 前期的研究已证实阴茎组织中腺苷浓度的升高导致ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠表现出阴茎异常勃起。本研究中，我们给予ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠不同剂量的PEG-ADA治疗以调节阴茎组织中的腺苷浓度处于不同水平，然后采用电刺激阴茎海绵体平滑肌条舒张实验以评估阴茎勃起功能。结果发现，自小鼠出生开始，高剂量的PEG-ADA治疗通过降低阴茎组织中的腺苷浓度能预防ADA基因缺陷小鼠阴茎海绵体平滑肌的过度舒张，从而预防阴茎异常勃起的发生。PEG-ADA治疗也能通过降低阴茎组织中的腺苷浓度逆转ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠阴茎海绵体平滑肌的过度舒张，提示了其在阴茎异常勃起中的治疗作用。
　　 本研究利用两种阴茎异常勃起的动物模型，在国际上首次发现PEG-ADA通过降低阴茎组织中的腺苷水平，能安全、有效地预防和治疗小鼠的阴茎异常勃起。该药针对阴茎异常勃起的发病机理，且已被美国FDA批准用于治疗ADA缺陷症患者，冈此，有望在不久的将来应用于临床治疗阴茎异常勃起。
　　 第三部分：PEG-ADA能有效地预防和逆转ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠的阴茎纤维化
　　 阴茎纤维化是阴茎异常勃起最为严重的并发症之一，可导致勃起功能障碍。通过本研究，我们证实阴茎组织中腺苷浓度的升高也导致ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠的阴茎血管损伤和阴茎组织纤维化。我们也给予ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠不同剂量的PEG-ADA治疗以降低阴茎组织中的腺苷浓度，随后采用组织病理学研究、免疫组化染色、Real-time PCR等方法评估阴茎纤维化的程度。结果发现，自小鼠出生开始，高剂量的PEG-ADA治疗能有效地预防ADA基因缺陷小鼠的阴茎血管损伤和阴茎纤维化。此外，PEG-ADA治疗也能逆转ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠的阴茎纤维化。
　　 通过本研究，我们在国际上首次证实阴茎组织中腺苷浓度的升高可导致阴茎纤维化的发生，PEG-ADA通过降低阴茎组织中的腺苷浓度，能有效地预防和治疗阴茎纤维化，有望应用于临床。
　　 第四部分：腺苷通过A2B腺苷受体介导阴茎纤维化
　　 我们的研究已经在ADA基因缺陷小鼠和SCD Tg小鼠两种阴茎异常勃起的动物模型中证实阴茎组织中腺苷浓度的升高可导致阴茎纤维化的发生。为探讨腺苷介导阴茎纤维化的分子机制，我们分离了阴茎海绵体成纤维细胞(Corpus Cavernosal Fibroblast Cell, CCFC)并进行原代培养。CCFC是介导纤维化过程的主要细胞类型。Real-Time PCR提示A2B腺苷受体为表达于CCFC的主要腺苷受体类型。通过体外实验手段，我们证实腺苷通过A2B腺苷受体导致CCFC中TGF-β的表达水平升高，TGF-β通过自分泌方式作用于CCFC细胞膜上的TGF-β受体而促进CCFC的细胞增殖和胶原质的合成，最终引起阴茎纤维化。
　　 本研究在国际上首次证实腺苷通过A2B腺苷受体上调TGF-β的水平，后者能促进CCFC细胞增殖和合成胶原质，最终导致阴茎纤维化的发生。本研究加深了对阴茎纤维化分子机制的认识。