E6.BARF1p调控CD/UPRT.UL49的表达对鼻咽癌的靶向放射-基因治疗研究

摘要

鼻咽癌是一类以放射治疗为主的恶性肿瘤,如何提高肿瘤的局控率及生存率、减轻放射治疗对正常组织的损伤、提高患者的生存质量一直是该病的研究重点,本文将分章讨论E6.BARF1启动子(简称BARF1p)调控CD/UPRT.UL49的表达对鼻咽癌的靶向放射-基因研究。
　　 第一部分、启动子报告基因载体的构建及启动子活性分析
　　 目的：设计BARF1基因的启动子序列,验证该序列是否具有启动子活性,通过比较该启动子在人鼻咽正常上皮细胞NP69和人鼻咽癌细胞CNE-2中的启动子活性,验证所设计的BARF1基因的启动子是否具有肿瘤相对特异性。
　　 方法：结合启动子预测软件结果(TRANSFAC和MATINSPECTOR)及引物设计软件(Primer premier5.0),设计BARF1基因的启动子序列,从B95-8细胞株中提取基因组DNA,PCR扩增所设计的BARF1基因的启动子,将扩增的启动子连接在荧光素酶报告基因载体上,通过脂质体介导,瞬时转染入NP69和CNE-2细胞细胞中,验证所设计的启动子是否具有启动子活性,同时比较该启动子在NP69细胞和CNE-2细胞中的的启动子活性的差异,验证该启动子是否具有肿瘤相对特异性,差异的比较采用SPSS10.0的t检验。
　　 结果：所设计的BARF1基因的启动子在CNE-2细胞中具有启动子活性,但是活性较低,而在NP69细胞中不具备启动子活性,且该启动子在CNE-2细胞中的启动子活性远高于NP69细胞,差异有统计学意义(p＜0.05)。
　　 结论：本研究设计的BARF1基因的启动子具有启动子活性,且该启动子具有肿瘤相对特异性。
　　 第二部分、建立稳定表达自杀基因的鼻咽癌细胞株
　　 目的：建立稳定表达自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2细胞自杀基因修饰细胞株。
　　 方法：构建真核基因表达质粒pcDNA3.1(-)E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49,经脂质体法转染CNE-2细胞,G418筛选出阳性克隆细胞并扩大培养,抽提阳性克隆细胞的总蛋白质,通过Western-blotting检测目的基因表达。
　　 结果：自杀基因CD/UPRT.UL49在CNE-2转染细胞内稳定表达。
　　 结论：本组通过脂质体转染技术,成功地建立了稳定表达CD/UPRT.UL49基因的CNE-2细胞株。
　　 第三部分、 E6.BARF1 p调控自杀基因CD/UPRT.UL49的表达对鼻咽癌细胞的体外杀伤效应
　　 目的：体外实验观察CD/UPRT.UL49/5-FC系统对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应。
　　 方法：给予野生型CNE-2细胞和稳定转染CD/UPRT.UL49的CNE-2细胞株不同剂量的γ射线照射,同时联合不同剂量前体药物5-Fc作用48h后,用MTT法检测细胞的杀伤效应；再给予野生型CNE-2细胞和稳定转染CD/UPRT.UL49的CNE-2细胞株2Gy的γ射线照射,联合200μg/ml前体药物5-FC作用48h后,流式细胞仪检测前体药物对表达CD/UPRT.UL49基因的CNE-2细胞的杀伤作用,并检测CD/UPRT UL49基因对CNE-2细胞的旁杀效应。统计分析采用SPSS10.0软件进行t检验及方差分析。P＜0.05表示有统计学意义。
　　 结果：表达自杀基因CD/UPRT.UL49的CNE-2细胞的生长受到不同程度的抑制,当仅有10％的CNE-2细胞表达CD/UPRT基因时,可以杀死37.46％的细胞。
　　 结论： CD/UPRT.UL49/5-FC自杀基因/前体药物系统对鼻咽癌CNE-2细胞具有直接杀伤和旁杀效应。
　　 第四部分、前体药物/自杀基因系统对鼻咽癌放射增敏的原位基因治疗实验研究
　　 目的：通过建立裸鼠CNE-2动物模型,观察自杀基因表达载体pcDNA3.1(-)E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49在前体药物干预下对鼻咽癌放射治疗的增敏效应。
　　 方法： CNE-2细胞接种裸鼠皮下建立鼻咽癌动物模型,进行脂质体包裹质粒DNA瘤内注射的原位基因(in situ)治疗实验,待肿瘤长至0.8-1.0cm时,将裸鼠随机分组,记录肿瘤体积,比较不同处理组的抑瘤效应,病理切片证实肿快性质,抽提肿瘤组织RNA,RT-PCR反应,确定CD/UPRT.UL49基因在肿瘤组织中的表达。
　　 结果：成功建立鼻咽癌动物模型,病理切片证实肿块为低分化鳞癌,通过原位基因治疗实验发现,各处理组均能抑制肿瘤生长,较对照组的抑瘤效应更明显(P＜0.01)。
　　 结论： E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49自杀基因载体具有放射诱导和相对肿瘤特异性双重特性,对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应,为鼻咽癌的基因-放射治疗开辟了新思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词注释

前言

技术路线

第一部分 启动子报告基因载体的构建及启动子活性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二部分 建立稳定表达自杀基因的鼻咽癌细胞株

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三部分 E6.BARF1p调控自杀基因CD/UPRT.ULA9的表达对鼻咽癌细胞的体外杀伤效应

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四部分 前体药物／自杀基因系统对鼻咽癌放射增敏的原位基因治疗实验研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

REVIEW

致谢

攻读学位期间发表的文章