无镁损伤和苯巴比妥干预对发育皮层神经元GABAAR亚单位表达的影响

摘要

第一部分无镁损伤对发育中皮层神经元GABAARα1和γ2亚单位的影响
　　 目的:研究无镁损伤对体外培养发育中皮层神经元GABAARα1和γ2亚单位表达以及神经细胞膜离子电流强度的影响。
　　 方法:建立原代培养胚胎大鼠大脑皮层神经元无镁诱导的损伤模型，分为正常细胞外液组(CTL组)和无镁细胞外液组(INJ组)。神经元在上述2种液体中孵育3h，然后恢复正常培养液继续培养。在无镁损害后1、7及12d时应用流式细胞技术、免疫细胞化学技术、实时定量PCR及全细胞膜片钳技术测定发育中大鼠皮层神经元GABAARα1和γ2亚单位蛋白和mRNA表达及K+、Ca2+膜电流的变化。
　　 结果:与CTL组相比较，在各时间点INJ组MTT代谢率无显著性差异。与CTL组相比较，INJ组损伤后1d时，GABAARα1mRNA表达显著降低(P<0.05)；在损伤后7d时，GABAARγ2 mRNA显著增高(P<0.05)。与CTL组相比较，INJ组在无镁损伤后12d时GABAARα1阳性细胞率显著下降(P<0.05)；损伤后7d时，GABAARγ2阳性细胞率显著下降，损伤12d时显著升高(P<0.05)。与CTL组相比较，INJ组无镁损伤后7d、12d时GABAARα1蛋白免疫化学累积光密度(AOD)显著降低(P<0.05)；损伤后1d和7d时，GABAARγ2蛋白免疫化学AOD显著降低，损伤后12d时显著增高(P<0.05)。随着培养时间延长，体外培养神经细胞的K+、Ca2+膜电流强度逐渐降低；无镁损伤后7d和12d时，INJ组K+和Ca2+电流较CTL组显著增高(P<0.05)。
　　 结论:早期无镁细胞外液处理可以诱导发育中大鼠皮层神经元GABAARα1亚单位表达后期下调：GABAARγ2亚单位早期下调，后期上调；GABAARγ2单位的变化早于仅α1亚单位。同时伴有K+、Ca2+膜离子电流增加。
　　 第二部分苯巴比妥对无镁诱导发育中神经元改变的影响
　　 目的：研究GABAR激动剂苯巴比妥(PB)对正常和无镁损害的体外培养发育中皮层神经元GABARα1和γ2亚单位表达以及神经元细胞膜离子电流强度的影响。
　　 方法：建立原代培养的胎鼠大脑皮层神经元无镁损伤模型,在培养基中加入PB,3d后更换为正常培养基(INJ+PB组),以CTL组作为阴性对照组,以PB加入CTL组作为阳性对照组(CTL+PB组)。在无镁损害后1、7及12d时应用流式细胞技术、免疫细胞化学技术、实时定量PCR及全细胞膜片钳技术测定发育中大鼠皮层神经元GABAARα1和γ2业单位蛋白和mRNA表达及K+、Ca2+膜电流的变化。
　　 结果：加入PB干预后,在无镁损伤后7d时,CTL+PB组和INJ+PB组较CTL组及INJ组MTT代谢率均显著降低(P0.05))；在无镁损伤后12d时,CTL+PB组和INJ+PB组较CTL组MTT代谢率显著降低(P0.05)。无镁损伤后1d时,INJ+PB组和CTL+PB组GABAARα1 mRNA表达均较CTL组显著降低(P0.05),损伤后7d时CTL+PB组较CTL组和INJ+PB组显著降低(P0.05)；损伤后7d、12d时CTL+PB组GABAARγ2 mRNA较CTL组和](?)NJ+PB组均显著增高(P0.05)。INJ+PB组和CTL+PB组与CTL组相比较,无镁损伤后12d时,GABAARα1亚单位阳性细胞率显著下降(P0.05),损伤后7d、12d时GABAARα1亚单位免疫化学AOD显著下降(P0.05); INJ+PB组与CTL组和CTL+PB组相比较,损伤后7d时GABAARγ2阳性细胞率显著下降,损伤后12d时显著升高(P0.05)。INJ+PB组和CTL+PB组与CTL组相比较,损伤后1d和7d时GABAARγ2蛋白免疫化学AOD显著减低,损伤后12d时显著增高(P0.05)。神经元细胞膜钾电流强度在损伤后1d时,CTL+PB组和INJ+PB组较CTL组显著性降低(P0.05)；损伤后7d和12d时,INJ组较其他三组显著性增高(P0.05)；损伤后12d时,CTL+PB较CTL组显著性降低(P0.05)。在损伤后7d和12d时,INJ组和INJ+PB组钙电流强度明显高于CTL组(P0.05)。
　　 结论：GABA受体激动剂PB直接影响体外培养神经元正常表达GABAARα1、γ2亚单位及离子通道电流,不能对无镁损伤后所产生的异常有所恢复。
　　 第三部分siRNA沉默GABAARα1亚单位表达对发育中皮层神经元的影响
　　 目的：通过RNA干扰(RNAi)技术抑制GABAARα1,亚单位表达,研究体外培养神经元存活及神经元细胞膜离子电流强度的变化。
　　 方法：应用OligoEngine RNAi软件设计针对大鼠GABAARα1,亚单位基因3'端非编码区的siRNA,再据每条siRNA合成2对互补的含siRNA正义链和反义链的DNA模板,以一条无关荧光标记的RNA序列作为阳性对照。体外培养皮层神经元更换新鲜DMEM+10％FBS的培养基后24 h进行转染。转染后72h时,应用荧光定量PCR和免疫细胞化学染色法测定GABAARα1亚单位表达变化；用锥虫蓝染色法检测转染神经元存活率；应用膜片钳方法测定RNAi抑制GABAARα1亚单位表达后,对体外培养神经元钾离子膜电流和钙离子膜电流影响。
　　 结果：应用荧光定量PCR和免疫细胞化学染色法显示转染后72小时GABAARα1亚单位mRNA和蛋白表达在阴性对照组与阳性对照组之间无显著性差异(P0.05), RNAi组中GABAARα1亚单位表达较阴性对照组有显著性差异(P0.05)。应用锥虫蓝染色方法显示转染后神经元存活率在各组之间无显著性差异(χ2=5.444;P0.05)。RNAi组转染细胞的钾离子和钙离子膜电流强度显著低于阴性对照组和阳性对照组(P0.001)。
　　 结论：GABAARα1亚单位表达受抑制后对神经元存活无显著影响,直接降低神经元细胞钾离子和钙离子膜电流。