OPG基因敲除小鼠骨质量和软组织钙化的特点

摘要

第一部分小鼠OPG基因敲除对下颌骨骨矿化及其微结构的影响。
　　 目的：应用显微CT(micro-CT，μ CT)研究小鼠OPG基因敲除对其下颌骨骨矿化、骨质量及其微结构的影响。
　　 方法：6周龄OPG基因敲除雌性小鼠(OPG-/-)和野生型雌性小鼠各10只，饲养后4周处死。提取小鼠尾部组织DNA行PCR鉴定；提取肝脏组织行western blotting，鉴定内源性OPG基因的表达；每组各7只，取右侧下颌骨行显微CT扫描；每组各3只，取右侧下颌骨，以10％EDTA脱钙，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察下颌骨的病理形态变化。
　　 结果：OPG-/-小鼠与野生型(WT)小鼠组比较，下颌骨前段和髁状突皮质骨组织的骨密度分别下降17％和10％；松质骨体积骨密度、组织骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁连接密度均显著下降；骨小梁间隔、骨小梁面积比和结构模型指数显著增加(P<0.05)；光镜下，可见OPG-/-小鼠下颌骨的松质骨变薄，出现多孔状，骨小梁数量减少，间距增大。
　　 结论：OPG基因敲除引起小鼠下颌骨松质骨骨量丢失和微结构退变，降低其皮质骨骨矿化水平，但骨矿化水平下降依不同区域而存在明显差异。
　　 第二部分 OPG基因敲除小鼠骨量丢失的评价。
　　 目的：系统评价OPG-/-小鼠的骨量丢失特点。
　　 方法：应用HE、扫描电镜及μCT观察OPG-/-小鼠的骨微结构和骨丢失改变；应用三点弯试验检测骨的生物力学性能；ELISA法检测血清TRAP-5b、B-ALP及RANKL含量；应用免疫组化方法观察骨组织B-ALP的表达；应用TRAP染色计算破骨细胞数目；应用带动物模型软件的DXA仪测定小鼠骨标本的总体骨密度(BMD)和骨矿含量(BMC)。
　　 结果：与WT小鼠相比，OPG-/-小鼠松质骨与皮质骨均出现明显骨丢失，伴显著的骨微结构破坏：松质骨骨小梁体积、面积密度、骨小梁数量和连接密度均下降，骨小梁间隔和结构模型指数增加，皮质骨骨厚度、内径周长、皮质骨密度亦明显降低；总体骨密度和骨矿含量减少；生物力学参数的改变包括：最大载荷、弹性模量和刚性系数明显下降；血清和骨组织中的B-ALP升高；血清TRAP-5b和RANKL升高；破骨细胞数目增多。
　　 结论：OPG-/-小鼠发生明显骨丢失，骨微结构破坏及生物力学性能下降；OPG-/-小鼠的骨吸收和成骨活性均升高，符合骨高转换状态。
　　 第三部分敲除小鼠OPG基因对心肌与血管钙化的影响。
　　 目的：观察OPG基因敲除小鼠的心肌与血管钙化和组织化学特性。
　　 方法：10周龄和20周龄的OPG-/-与WT小鼠各10只。采用全自动生化分析仪测定血清钙和血清磷水平；应用ELISA法测定血清B-ALP及RANKL含量。取主动脉和心肌组织，石蜡包埋：①应用HE切片观察各组小鼠钙化情况；②应用TRAP染色，观察钙化处的破骨细胞数目；③应用免疫组化检测RANKL及BMP的表达。取主动脉及心肌组织，干燥后，10％甲酸消化，用比色法测定血管及心肌的钙含量。
　　 结果：与WT小鼠相比，OPG-/-小鼠主动脉和心肌出现显著钙化，随着周龄的增加，钙化程度加重；血清B-ALP、RANKL水平升高，主动脉及心肌组织有RANKL、BMP蛋白表达，而WT小鼠主动脉和心肌未见到RANKL与BMP的表达；血清钙和磷无明显变化；主动脉及心肌钙化部位的TRAP染色均未发现破骨细胞。
　　 结论：OPG-/-小鼠主动脉和心肌出现钙化；血清的成骨指标ALP增高，而血清钙与磷无增高，提示血管和心肌的钙化与主要骨形成有关，而与血清钙磷代谢无直接关系。