水稻抗性基因和无毒基因互作的广谱抗病基因工程研究

摘要

水稻的高产稳产直接关系着国家粮食安全和社会稳定。稻瘟病害造成的粮食减产已成为我国粮食产量增长缓慢的主要原因之一。喷施农药防治病害给环境造成重大污染,而且效果不佳。多数抗病品种在生产上推广3-5年后就因为病原菌变异产生新的生理小种而导致抗性丧失。培育持久抗病品种防治稻瘟病需要创新抗病育种策略。水稻与稻瘟病菌之间的特异互作符合“基因对基因”(gene-for-gene)假说。根据这一假说,de Wit提出植物双因子广谱抗性策略:即将R基因和相应的Avr基因置于病原菌侵入诱导表达的启动子下导入寄主植物,当寄主受到病菌侵染时,Avr基因便被诱导表达Avr蛋白,激发其特异R基因表达产生对应的受体蛋白,它们之间相互识别,导致寄主的HR反应,阻止入侵病原菌的定殖和扩展,同时还会进一步诱导系统获得性抗性(systemic acquired resistance.SAR),使植物获得对多种病原菌的广谱抗性。而其关键就是互作的R/Avr基因对以及只能由病原菌侵染所触发的适当的启动子。本研究基于这一广谱抗病基因工程育种策略,筛选受稻瘟菌侵入诱导特异表达的启动子,将互作的水稻抗稻瘟病基因Piz-t和稻瘟病菌无毒基因Avr-pizt置于这一启动子下,构建双元表达载体。同时建立基于本研究转基因受体水稻品种的农杆菌介导水稻转基因优化体系,期望将特异诱导表达基因对转入水稻中,实现广谱抗病育种,提高水稻的抗性。
　　 本研究取得如下结果:
　　 1、以前人研究结果的23个启动子为基础,进一步筛选分析,选取其中9个作为候选启动子并进行克隆。对这9个启动子进行稻瘟病侵染后Oh到96h的表达分析,发现基因Loc_04g10160的表达呈现“低-高-低”的特点,因而成为本研究的首选特异启动子;
　　 2、分别构建完成9个启动子3种载体共27个表达载体,其中包括将9个候选启动子分别替换pCambia1305.2中启动Gus基因的CaMV35S启动子而构建成的pCSPIRB(pCambia vector for Screen Promoter Induced byRice Blast Invasion)载体;候选启动子与无毒基因AvrPiz-t以及水稻抗稻瘟病基因Piz-t组成的pCDRRB1(pCambia vector for Durable Resistance toRice Blast)系列载体;候选启动子与无毒基因AvrPiz-t50以及水稻抗稻瘟病基因Piz-t组成的pCDRRB2系列载体。
　　 3、通过设置不同培养基、激素配比、农杆菌浸染时间等实验处理,建立了适合受体品种Y58S的农杆菌介导水稻转基因优化体系,使构建的双元表达载体高效转移到水稻中。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 水稻抗稻瘟病基因工程研究进展

1.1.1 “基因对基因”假说

1.1.2 水稻抗稻瘟病基因的克隆

1.1.3 无毒基因的克隆研究

1.1.4 受稻瘟病菌侵染诱导表达的启动子研究进展

1.2 农杆菌介导水稻转基因技术研究进展

1.2.1 水稻农杆菌转基因原理

1.2.2 农杆菌介导水稻转基因发展回顾和最新进展

1.2.3 农杆菌介导水稻遗传转化的基本因素

1.3 本研究的目的和意义及技术路线

1.3.1 本研究的目的和意义

1.3.2 本研究的技术路线

第二章 特异启动子的克隆与表达分析及双元载体的构建

引言

2.1 材料和方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 启动子的克隆

2.2.2 启动子表达分析

2.2.3 双元载体构建

2.3 结论

第三章 农杆菌介导水稻转基因体系的优化

引言

3.1 农杆菌介导的高效组培体系的建立

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 农杆菌介导Y58S籼稻遗传转化体系初探

3.2.1 实验材料

3.2.2 操作步骤

3.3 结果和讨论

3.3.1 农杆菌介导的高效组培体系建立

3.3.2 农杆菌介导的水稻遗传转化体系初探

3.3.3 本章小结

第四章 讨论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文