人骨髓间充质干细胞与骨诱导活性材料构建组织工程骨的实验研究

摘要

目的：
　　 骨缺损，尤其大段骨缺损，其治疗仍是骨科临床所面临的难题之一。传统采用的植骨材料多缺乏生物活性，在体内的降解速率快慢不一，促成骨作用往往有限。骨髓间充质干细胞来源广泛，取材方便，具有自我更新和多向分化的能力，体内体外实验均已证实其具有很强的成骨能力，是骨组织工程研究理想的种子细胞。骨诱导活性材料具有三维立体结构，生物相容性好，在体内可降解，符合骨组织工程对生物支架材料的要求。目前，种子细胞与支架材料复合所面临的问题是，种子细胞的接种效率低下，流失量大，以及细胞在支架内的不均匀分布。本课题采用骨诱导活性材料为载体，对人自体骨髓来源的间充质干细胞进行体外三维培养，构建个体化的组织工程骨。同时，采用自体富含血小板血浆(PRP)作为种子细胞的双相接种媒介，增加细胞的黏附和成骨，以构建适合临床应用的组织工程骨，为骨缺损的临床个体化移植治疗提供有用的实验数据，具有重大的应用前景。
　　 方法：
　　 1.人骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定。
　　 采集骨髓，比较全骨髓贴壁和密度梯度离心两种方法细胞分离效率，比较细胞在胎牛血清和自体血清中的生长，观察细胞形态变化，流式检测免疫表面标志物的表达。MTT法测定第3、5代细胞的增殖，绘制生长曲线。
　　 2.人骨髓间充质干细胞的诱导分化及成骨能力研究。
　　 取自体血清培养的第3代细胞，分别进行体外成脂和成骨诱导。镜下观察细胞形态变化，以油红O染色检验细胞的成脂性，以Ⅰ型胶原、骨钙素和钙化结节检验细胞的成骨性；比较成骨诱导组与非诱导组细胞的ALP含量；RT-PCR检测两组的ALP和OPN mRNA表达。
　　 3.人骨髓间充质干细胞与骨诱导活性材料-富含血小板血浆凝胶复合物构建组织工程骨的体外实验研究。
　　 以BrdU标记第3代细胞，用免疫细胞化学染色检验。取第3代细胞以传统静置接种法和PRP双相接种法构建细胞-生物支架复合物，比较两组接种细胞的黏附率，测定两组复合物的ALP含量差别；RT-PCR检测两组ALP和OPN mRNA表达差别。以扫描电镜观察细胞在材料内的生长增殖和基质分泌情况。
　　 4.人骨髓间充质干细胞与骨诱导活性材料-富含血小板血浆凝胶复合物构建组织工程骨的体内实验研究
　　 以新西兰大白兔建造股骨骨缺损动物模型，将构建的组织工程骨分为3组：Ⅰ组为单纯骨诱导材料组；Ⅱ组为传统静置法构建工程骨组；Ⅲ组为双相接种构建工程骨组。分别移植入动物模型体内修复骨缺损，观察术后动物一般情况；X线检查，观察骨缺损处成骨情况；组织切片HE染色观察支架材料降解、新生骨生长情况。
　　 结果：
　　 1.经全骨髓贴壁分离和密度梯度离心两种方法都可成功分离细胞，自体血清培养和胎牛血清均可培养出成纤维样细胞。MTT法生长曲线显示第3、5代细胞均有较强的增殖能力。密度梯度离心自体血清培养的第5代细胞流式细胞仪检测，其表达CD44、CD90，不表达CD34、CD45。
　　 2.第3代人骨髓间充质干细胞成骨诱导21天后，Ⅰ型胶原、骨钙素和钙化结节染色阳性；成脂诱导21天后油红O染色阳性；在成骨诱导过程中，ALP含量逐渐增高，与未诱导组比较有统计学差异(P<0.05)；RT-PCR结果显示诱导组和未诱导组均有ALP表达，未诱导组表达较弱，诱导组中有OPN表达，而未诱导组则无表达。
　　 3.以BrdU标记第3代细胞，用免疫细胞化学染色阳性；以传统静置接种法和PRP双相接种法构建细胞-生物支架复合物，分别比较细胞接种4h，8h，12h，24h后细胞粘附率，后者高于前者，有统计学差异(P<0.05)；两种方法接种细胞成骨诱导后ALP含量逐渐增高，后者高于前者，有统计学差异(P<0.05)；RT-PCR结果显示两种方法接种诱导组和未诱导组均有ALP和OPN表达，但未诱导组表达较弱；扫描电镜观察PRP双相接种法构建组织工程骨，细胞在材料表面生长，并可延入材料孔隙之中，有基质分泌。
　　 4.各组组织工程骨植入兔股骨骨缺损处，伤口生长良好一期愈合，无不良反应。X线显示实验组在术后12周基本达到骨愈合，对照组在术后12周时愈合可，空白组骨愈合不满意。HE染色观察到空白组8周后骨诱导活性材料基本被吸收，对照组和实验组8周起可见支架的材料降解和新生骨组织，12周可见实验组成骨更好。
　　 结论：
　　 1.密度梯度离心法分离和自体血清培养获得的成分均一、增殖能力强的人骨髓间充质干细胞可作为种子细胞。
　　 2.富含血小板血浆双相接种法可促进人骨髓间充质干细胞与骨诱导活性材料的黏附及成骨，有利于构建组织工程骨。
　　 3.构建的组织工程骨移植到骨缺损兔体内可增加骨缺损处的成骨，促进骨愈合。