单叶铁线莲总皂苷提取、纯化工艺及抗类风湿关节炎的初步研究

摘要

一、目的
　　 建立单叶铁线莲总皂苷(TsCH)TsCH的含量测定方法,研究适宜TsCH提取和纯化的工艺条件,考察TsCH的抗炎活性及作用机制,充分利用单叶铁线莲资源,开发以TsCH为主要成分治疗类风湿关节炎的中药新药。
　　 二、方法
　　 1.TsCH的含量测定:选用齐墩果酸为对照品,采用比色法,以5％香草醛-冰醋酸溶液和高氯酸为显色剂,在550nm处测定吸光度。以齐墩果酸的量(mg)为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标,制作标准曲线,计算得回归方程,进行方法学考察。
　　 2.TsCH微波提取工艺:以TsCH转移率为指标,将微波提取法与加热回流提取法及超声提取法进行比较;在单因素实验的基础上,运用正交实验设计,筛选最佳微波提取工艺。
　　 3.TsCH的纯化工艺:采用静态吸附-解吸和动态吸附-洗脱考察相结合的方法,筛选5种不同性质的大孔树脂;根据筛选出来的树脂进行动态吸附洗脱参数的考察。
　　 4.TsCH对类风湿关节炎大鼠作用的考察:雌性SD大鼠48只,随机分为5组:正常对照组,模型对照组,阳性对照(甲氨蝶呤,1 mg·kg-1·w-1)组,TsCH高、低剂量组(150、50mg·kg-1·d-1)。除正常对照组外,其余注射Ⅱ型胶原造模。灌胃给药,持续5周,观察动物一般情况及体重,测定足趾容积和厚度。5周后处死动物,腹主动脉采血测定血清中免疫球蛋白G(IgG)、白介素-1β(IL1-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量;取大鼠踝关节组织切片,检查关节组织病理学。
　　 三、结果
　　 1.TsCH的含量:测定所得回归方程为Y=3.5913X+0.0077,相关系数R2=0.9994,线性范围0.036～0.216 mg。以此计算TsCH的含量。方法学实验结果显示,显色在120min内吸收值稳定,RSD为1.97％,精密度和重复性良好,RSD分别1.04％和3.11％;平均回收率为97.90％(n=9),RSD为2.08％。
　　 2.TsCH微波提取工艺结果表明,以70％乙醇为提取溶剂,微波功率300W,料液比1:26,提取3次,每次提取6 min,TsCH的转移率可达95％左右。
　　 3.TsCH的纯化工艺:根据静态吸附、洗脱实验初步确立了D-101型大孔树脂为分离TsCH的树脂,动态考察所得纯化工艺参数为:上样浓度为0.2 g生药·mL-1,pH值为5,以1 BV/h的流速上样,4 BV蒸馏水2 BV/h的流速洗脱杂质,4 BV70％乙醇以2 BV/h的流速洗脱总皂苷。研究结果表明,未纯化前总固物中总皂苷的含量为29.95％,纯化后总固物中的TsCH含量为71.56％,精制度达238.92％,转移率达到86.03％。
　　 4.TsCH对类风湿关节炎大鼠作用的考察观察:TsCH对Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠的影响。结果发现,注射Ⅱ型胶原两次,21天后造模成功。与模型组相比,TsCH能明显降低关节炎指数评分,减小足趾容积,足趾厚度有降低趋势;能降低血清中IgG、IL1-β、TNF-α水平;关节组织病理学检查显示TsCH对减轻滑膜增生和炎细胞浸润表现出了较好的作用趋势;TsCH对RA大鼠的疗效具有剂量依赖性关系。
　　 四、结论
　　 1本文研究确定的TsCH的制备工艺方法效率高、选择性好,为TsCH的工业化生产提供了参考。
　　 2.通过Ⅱ型胶原诱导的关节炎大鼠模型动物实验表明TsCH对Ⅱ型胶原诱导型关节炎大鼠能缓解症状和改善病变,对类风湿关节炎有防治作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一章 单叶铁线莲总皂苷含量测定方法的建立

1 仪器与试药

1.1 仪器

1.2 试剂与药品

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

2.2 样品溶液的制备

2.3 检测波长的确定

2.4 标准曲线的制定

2.5 样品含量测定

2.6 方法学的考察

3 结果

3.1 检测波长的确定

3.2 标准曲线和回归方程的建立

3.3 方法学考察试验

3.4 TsCH含量测定方法的确定

4 讨论

第二章 单叶铁线莲总皂苷提取工艺的研究

1 仪器与试药

1.1 仪器

1.2 试剂与药品

2 方法

2.1 原药材处理

2.2 对照品和与标准曲线的制备

2.3 样品液的制各和样品含量测定

2.4 微波提取工艺条件单因素考察

2.5 正交实验优选TsCH微波提取工艺参数

2.6 不同提取工艺的比较

3 结果

3.1 标准曲线

3.2 微波提取条件对TsCH转移率的影响

3.3 正交实验优选TsCH微波提取工艺参数

3.4 加热回流提取、超声提取、微波提取方法的比较

4 讨论

第三章 单叶铁线莲总皂苷纯化工艺的研究

1 仪器与试剂

1.1 仪器

1.2 试剂与药品

2 方法

2.1 对照品溶液的制备和标准曲线的绘制

2.2 上样液的制备与含量测定

2.3 大孔吸附树脂的预处理

2.4 树脂的筛选

2.5 大孔吸附树脂对TsCH的动态吸附性能研究

2.6 工艺重复验证实验

2.7 树脂使用次数对纯化性能的影响

3 结果

3.1 标准曲线的制备

3.2 上样液里总皂苷的含量测定

3.3 不同大孔吸附树脂对TsCH静态吸附-解析性能的比较

3.4 泄露曲线

3.5 D101大孔吸附树脂对TsCH的动态吸附-洗脱研究

3.6 工艺重复性验证实验

3.7 树脂使用次数对纯化性能的影响

4 讨论

第四章 单叶铁线莲总皂苷对类风湿关节炎大鼠的治疗作用及机制的初步研究

1 仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

2 实验方法

2.1 实验用药物的制备

2.2 类风湿关节炎大鼠模型构建

2.3 实验动物分组与给药

2.4 观察指标与检测方法

2.5 数据处理

3 结果

3.1 一般情况及体重变化

3.2 关节炎指数观察结果

3.3 足趾容积测定结果

3.4 足趾厚度测定结果

3.5 血清IgG、血清细胞因子测定结果

3.6 关节组织病理学检查结果

4 讨论

全文总结

展望

参考文献

综述 铁线莲属植物药理活性研究进展

致谢

攻读硕士期间主要的研究成果