IL-1α在沙眼衣原体感染Hela229细胞中的表达及稳定表达IL-1α shRNA细胞系的构建

摘要

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)是一种常见的、严格细胞内寄生的病原体。Ct侵犯机体可引起泌尿生殖道感染，更为严重的是Ct感染与不孕、异位妊娠、宫颈鳞状上皮细胞癌等疾病发生相关。Ct可诱导上皮细胞产生IL-1α、IL-6和TNF-α等多种炎症因子，参与免疫应答，其中IL-1α进一步诱导细胞因子（包括其自身、IL-6和IL-8等），参与Ct感染导致的组织损伤。因此，研究IL-1α在早期炎症中的作用，为Ct感染的发病机制、疾病预防和治疗提供实验依据。
　　 目的:
　　 1、通过探讨IL-1α在Ct感染HeLa229细胞前后，细胞内、外IL-1α的表达情况，明确IL-1α在Ct感染细胞的炎症早期的表达模式;
　　 2、构建稳定表达IL-1α shRNA的细胞系，为后续研究Ct诱导炎症机制提供实验材料。
　　 方法:
　　 1、Ct感染Hela229细胞，吉姆萨染色后，光学显微镜观察确定Ct包涵体，以建立Ct感染Hela229细胞的模型;
　　 2、用ELISA检测IL-1α在Ct感染Hela229细胞内以及培养上清中的表达;
　　 3、利用基因克隆方法构建IL-1α shRNA表达质粒，转染Hela229细胞，经G418筛选，构建稳定表达IL-1αshRNA的细胞系;
　　 4、通过ELISA法检测各稳定转染重组质粒的细胞IL-1α的表达，筛选出有效抑制内源性IL-1α表达的稳定细胞系。
　　 结果:
　　 1、光学显微镜示细胞内的透明折光体为Ct的包涵体，表明Ct感染Hela229细胞模型已建立;
　　 2、Ct感染Hela229细胞36h，与未感染组相比，胞内IL-1α明显上升，有显著差异（P＜0.05）;
　　 3、成功构建重组质粒pRNAT6.1/Neo-siRNA1、2、3、4（4种IL-1αshRNA质粒），经DNA测序4种重组质粒序列正确;
　　 4、透过荧光显微镜可见:90％以上稳定转染细胞有绿色荧光GFP表达;
　　 5、Ct成功感染IL-1α shRNA稳定细胞系，镜下观察细胞内未着色空洞即Ct包涵体，表明成功建立Ct感染各稳定细胞系的模型;
　　 6、各稳定转染的细胞系（Ct感染组和TNF-α刺激组）中，psi4-IL-1α-Hela229细胞（IL-1α shRNA稳定细胞系）胞内IL-1α表达量显著低于对照组psi-Neg-Hela229细胞(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1、IL-1α在Ct感染Hela229细胞早期以细胞内表达为主;
　　 2、成功构建稳定表达IL-1αshRNA的细胞系（psi-IL-1α-Hela229细胞），为后续实验研究提供了实验材料。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 IL-1α在Ct感染Hela229细胞中的表达

1．1 前言

1．2 材料和方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

第二章 稳定表达IL-1α shRNA细胞系的构建

1．1 前言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

总结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间主要研究成果