受体相互作用蛋白3在大鼠急性高眼压视网膜神经节细胞中表达变化的初步研究

摘要

目的:研究受体相互作用蛋白3(Receptor Interacting Protein3，RIP3)在正常大鼠视网膜中的分布以及急性眼高压早期大鼠视网膜RIP3表达的时空变化，初步探讨急性高眼压早期导致视网膜节细胞损伤的可能分子机制。
　　 方法:(1)随机挑选6只健康的成年Sprague-Dawley大鼠，3只活取视网膜组织匀浆后进行免疫蛋白印迹法检验抗体特异性，3只灌注取材之后冰冻切片进行抗体吸收实验和免疫组织化学染色以及RIP3与Neuron-specifc nuclear antigen(NeuN，神经节细胞标志物)、Calbindin(CB，水平细胞标志物)、Glial fibrillary acidic protein(GFAP,星形胶质细胞标志物)、Glutamine synthetase(GS，Müller细胞标志物)、Protein kinase C alpha(PKC-α，双极细胞标志物)、Parvalbumin(PV，无长突细胞标志物)、Rhodopsin(视细胞标志物)、Synaptophysin(突触标志物)、Integrin，alpha M(CD11b，小胶质细胞标志物)免疫荧光组织化学双标染色，分析RIP3在正常成年大鼠视网膜不同细胞类型中的表达分布;(2)挑选18只健康的成年Sprague-Dawley大鼠按照存活时间随机分为6小时、12小时、24小时三个组，每组6只。一侧眼球进行加压处理、另一侧眼球作为自体对照，不作任何处理。高眼压侧眼球在眼前房插针加压，维持压力至110毫米汞柱1小时，下架存活至相对应的时间点后，每个小组随机取3只大鼠注射过量的麻药后冰上快速剥离视网膜组织，免疫蛋白印迹法分析RIP3的表达量。每组另外3只大鼠灌注取材用免疫荧光染色分析RIP3在视网膜中的表达变化。
　　 结果:1.RIP3在正常成年大鼠视网膜中的免疫组织化学染色显示:神经纤维层和节细胞层染色最强，内核层染色强度较弱可见颗粒状细胞形态，内网层染色强度最弱，在外网层边缘部分可见少量染色较浅的RIP3阳性细胞分布，外网层未见明显阳性细胞染色，染色强度较弱;2.免疫荧光组织化学双标染色显示:在节细胞层，RIP3的阳性产物与NeuN阳性产物存在明显双标;在内核层靠近内网层边缘部分与部分PV阳性产物存在明显双标;在内核层靠近外网层边缘部分与部分CB阳性产物存在明显双标，此外，RIP3与PKC-α，GS阳性产物，GFAP阳性产物以及CD11b阳性产物呈现微弱的双标;3.在急性高眼压处理以后，Western blot显示RIP3表达明显增强，表现为6小时、12小时的条带明显增粗，24小时条带较12小时弱;免疫荧光染色显示:急性高眼压损伤后，损伤组与正常对照组相比RIP3阳性染色分布未见明显变化，节细胞层的RIP3阳性染色明显较对照组强，其中12小时染色最强，6小时和24小时的染色强度较空白对照组有所增强，但较12小时染色弱。
　　 结论:RIP3主要分布于视网膜节细胞，并在部分无长突细胞和水平细胞以及胶质细胞内表达，而在其他类型的视网膜细胞未见明显表达。急性高眼压早期可导致视网膜节细胞RIP3的表达上调。

目录

声明

摘要

英文缩略词简表

前言

第一章 材料和方法

1．1 实验动物和饲养条件

1．2 主要仪器和软件

1．3 实验试剂及耗材

1．4 实验方法

1．4．1 动物分组、造模

1．4．2 动物处理及标本收集

1．4．3 RIP3抗体鉴定和吸收实验

1．4．4 免疫荧光化学染色

1．4．5 免疫组织化学染色

1．4．8 Western blot检测

1．4．9 数据收集和统计

第二章 结果

2．1 RIP3抗体特异性的验证

2．2 RIP3在正常大鼠视网膜中的大体分布

2．3 RIP3在正常大鼠视网膜中不同类型细胞的定位

2．4 急性高眼压下RIP3蛋白的表达变化

第三章 讨论

3．1 RIP3主要分布于视网膜内层神经细胞中

3．2 大鼠急性高眼压早期视网膜节细胞RIP3表达上调

第四章 结论

第五章 图片与说明

参考文献

综述

致谢

在读期间发表的文章、所获成果，参与课题研究情况