S1P2受体介导内皮细胞衰老的作用研究

摘要

目的：
　　 通过分析体外培养的脐静脉内皮细胞衰老模型和来自老年大鼠的肺微血管内皮细胞中1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate，S1P)受体的表达与细胞功能改变的关联性，探讨S1P受体在内皮细胞衰老过程中的作用，试图阐明S1P受体途径促内皮细胞衰老的作用及为预防老年心血管疾病提供实验依据。
　　 方法：
　　 1.在体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells，HUVECs)衰老过程中，分析S1P受体表达和内皮细胞功能的变化:分离人脐静脉内皮细胞，加入M199完全培养基进行培养，每3天传代一次。将细胞分组:内皮细胞培养至累积细胞群体倍增值(cumulative population doubling level，CPDL)约为15时，收集细胞，作为年轻细胞组(young cells，Y);CPDL约为35时，作为中年细胞组(intermediate cells， I);CPDL约为60时，作为衰老细胞组(senescent cells，S)。运用RT-PCR检测年轻、中年和衰老内皮细胞的S1P受体mRNA的表达;采用Western blot检测年轻、中年和衰老内皮细胞的S1P受体蛋白的表达;应用Matrigel胶种植法评价年轻、中年和衰老内皮细胞体外管状样结构形成能力;利用细胞跨膜迁移实验分析年轻、中年和衰老内皮细胞的趋化能力。
　　 2.S1P2受体的shRNA腺病毒载体（shRNA-S1P2）构建及筛选:设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸(ss oligo)，经变性、退火形成双链寡核苷酸(ds oligo)，并插入穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle载体，测序验证后经脂质体介导转染人肺动脉内皮细胞（human pulmonary artery endothelial cells，HPAEC），通过RT-PCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA，然后提取质粒DNA，经双酶切，回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段，再亚克隆至腺病毒表达载体(pAdeno-X)，筛选出正确的重组子，转染到HEK293A细胞，收集重组的腺病毒，测定病毒滴度，通过Western blot方法检测S1P2受体基因沉默的效果。
　　 3.调控S1P2受体的表达并分析其对体外脐静脉内皮细胞功能的影响:(1)过表达S1P2受体，观察体外脐静脉内皮细胞的功能变化:将培养的年轻脐静脉内皮细胞分别转染空质粒载体(pcDNA3.1)和重组质粒载体(pcDNA3.1/S1P2);运用RT-PCR和Western blot检测空白对照内皮细胞、转染空质粒pcDNA3.1和转染重组质粒pcDNA3.1/S1P2的内皮细胞S1P受体的表达;应用Matrigel胶种植法评价空白对照组、转染空质粒pcDNA3.1组和转染重组质粒pcDNA3.1/S1P2组内皮细胞的体外管状样结构形成能力;采用细胞划痕实验检测空白对照组、转染空质粒pcDNA3.1组和转染重组质粒pcDNA3.1/S1P2组内皮细胞的损伤修复能力;利用细胞跨膜迁移实验分析空白对照组、转染空质粒pcDNA3.1组和转染重组质粒pcDNA3.1/S1P2组内皮细胞的趋化能力;(2)沉默S1P2受体的表达并检测体外衰老脐静脉内皮细胞的功能改变。将培养的衰老脐静脉内皮细胞分为3组:空白对照组细胞、干扰组细胞（转染shRNA-S1P2腺病毒载体）和干扰对照组细胞（转染对照荧光素酶基因shRNA-Luc腺病毒载体）。采用RT-PCR和Western blot检测空白对照组、干扰组和干扰对照组细胞S1P2受体的表达;应用Matrigel胶种植法评价空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞体外管状样结构形成能力;运用细胞划痕实验检测空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞的损伤修复能力;使用细胞跨膜迁移实验分析空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞的趋化能力。
　　 4.分析老年大鼠的肺微血管内皮细胞S1P受体的表达和内皮细胞功能的变化:(1)分离年轻和老年大鼠的肺微血管内皮细胞，运用RT-PCR和Western blot检测年轻和老年大鼠肺微血管内皮细胞的S1P受体表达;应用Matrigel胶种植法评价年轻和老年大鼠的肺微血管内皮细胞管状样结构的形成能力;采用细胞划痕实验检测年轻和老年大鼠肺微血管内皮细胞的损伤修复能力;使用细胞跨膜迁移实验分析年轻和老年大鼠肺微血管内皮细胞的趋化能力;(2)沉默S1P2受体的表达，检测老年大鼠的肺微血管内皮细胞的功能改变:将分离的老年大鼠的肺微血管内皮细胞分为3组处理，即空白对照组细胞，干扰组细胞（转染shRNA-S1P2腺病毒载体），干扰对照组细胞（转染对照shRNA-Luc腺病毒载体）;采用RT-PCR和Western blot检测空白对照组、干扰组和干扰对照组细胞S1P2受体的表达;应用Matrigel胶种植法评价空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞管状样结构的形成能力;运用细胞划痕实验检测空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞的损伤修复能力;使用细胞跨膜迁移实验分析空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞的趋化能力。
　　 结果：
　　 1.在体外培养的衰老脐静脉内皮细胞，S1P2受体的表达明显上调，而血管形态发生能力、损伤修复能力及迁移能力均显著下降。
　　 2.在体外培养的年轻脐静脉内皮细胞，上调S1P2受体的表达可明显降低内皮细胞的血管形态发生能力、损伤修复能力及迁移能力。
　　 3.在体外培养的衰老脐静脉内皮细胞，下调S1P2受体的表达可显著增强内皮细胞的血管形态发生能力、损伤修复能力及迁移能力。
　　 4.在老年大鼠的肺微血管内皮细胞，S1P2受体的表达明显上调，且管状结构的形成能力、损伤修复能力及迁移能力均显著下降;下调S1P2受体的表达，可显著恢复内皮细胞的血管形态发生能力、损伤修复能力及迁移能力。
　　 结论：
　　 1.在体外培养的脐静脉内皮细胞的衰老过程中，S1P2受体的表达上调与内皮细胞的血管形态发生、损伤修复及迁移能力下降相关联;S1P2受体介导体外衰老的脐静脉内皮细胞的功能变化;
　　 2.体内进一步验证了S1P2受体介导老年大鼠肺微血管内皮细胞的血管形态发生、损伤修复及迁移等功能受损;
　　 3.为临床预防和干预血管的衰老提供了新的思路。

目录

声明

摘要

技术路线

缩略词简表

前言

第一章 脐静脉内皮细胞衰老过程中S1P受体表达和细胞功能改变的相关性

1．1 材料与方法

1．1．1 材料

1．1．2 方法

1．2 结果

1．2．1 光镜形态学观察和细胞免疫荧光鉴定原代分离和培养的脐静脉内皮细胞

1．2．2 培养脐静脉内皮细胞的衰老相关-β-半乳糖苷酶染色

1．2．3 RT-PCR检测年轻、中年和衰老脐静脉内皮细胞的S1P受体的mRNA表达

1．2．4 Western blot检测年轻、中年和衰老脐静脉内皮细胞的S1P受体的蛋白表达

1．2．5 细胞跨膜迁移实验分析年轻、中年和衰老脐静脉内皮细胞的趋化性

1．2．6 S1P处理和对照的3组脐静脉内皮细胞的体外管状样结构形成

1．3 讨论

1．4 结论

第二章 S1P2受体的shRNA腺病毒载体的构建及筛选

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果

2．2．1 pRNAT-H1．1／Shuttle-shRNA重组质粒的酶切和PCR鉴定结果

2．2．2 转染pRNAT-H1．1／Shuttle-shRNA质粒到人肺动脉内皮细胞后，RT-PCR筛选最佳沉默效果的重组质粒

2．2．3 重组腺病毒的鉴定、包装及其滴度测定

2．2．4 采用Western blot技术鉴定重组腺病毒shRNA-S1P2对HPAEC S1P2受体基因沉默的效果

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 调控S1P2受体表达后对脐静脉内皮细胞的功能影响

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果

3．2．1 RT-PCR和Western blot检测转染空白质粒和S1P2重组质粒的年轻内皮细胞的S1P2受体的mRNA和蛋白表达

3．2．2 过表达S1P2受体对年轻脐静脉内皮细胞的体外管状样结构形成、损伤修复和迁移能力的影响

3．2．3 沉默S1P2受体后，采用RT-PCR和Western blot检测衰老脐静脉内皮细胞的S1P2受体的mRNA和蛋白表达

3．2．4 沉默S1P2受体对衰老脐静脉内皮细胞的体外管状样结构形成、损伤修复和趋化反应的影响

3．3 讨论

3．4 结论

第四章 S1P2受体对老年大鼠的肺微血管内皮细胞的作用研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 采用光镜观察形态学和细胞免疫荧光技术鉴定原代分离的大鼠PMECs

4．2．2 采用RT-POR和Western blot检测年轻和老年大鼠PMECs的S1P受体的mRNA和蛋白表达

4．2．3 来自老年大鼠的PMECs对S1P诱导的内皮形态发生、损伤修复和趋化反应

4．2．4 沉默S1P2基因后，衰老PMECs空白对照组、干扰组和干扰对照组的S1P2受体mRNA和蛋白表达

4．2．5 沉默S1P2受体对衰老PMECs的形态发生、损伤修复和趋化反应的影响

4．3 讨论

4．4 结论

总结论

参考文献

综述

致谢

攻读学位期间的研究成果