鼻咽癌顺铂耐药细胞系的建立及耐药蛋白质组学研究

摘要

研究背景
　　鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方最常见的恶性肿瘤之一,绝大多数NPC分化差,恶性程度高,易早期发生颈淋巴结和远处转移。目前,鼻咽癌的临床治疗主要以放疗和化疗为主,5年生存率约50％-70％之间。中晚期NPC临床疗效差,再加上在鼻咽癌治疗过程中往往会出现多药耐药性(multi-drug resistance,MDR),而导致化疗失败。因此,研究鼻咽癌耐药的分子机制很有必要。
　　MDR是指恶性肿瘤细胞在接触一种抗癌药后,产生了对多种结构不同、作用机制各异的其他抗癌药的耐药性。MDR是恶性肿瘤化疗失败和复发的重要原因之一,涉及到多种复杂的分子机制,其中,以多药耐药相关蛋白(multi-drug resistance protein,MRP)在抗癌药物耐药中所起的作用备受重视。
　　比较耐药肿瘤细胞与其对应的亲本肿瘤细胞之间差异表达的蛋白质,可以发现与耐药相关的蛋白质,为筛选肿瘤耐药的分子标志物及肿瘤耐药的靶向治疗提供了新的研究方向。
　　第一章鼻咽癌顺铂耐药细胞系的建立
　　目的:本研究通过顺铂(cis-Diammine-Dichloro-Platinum,cDDP)浓度递增法建立了鼻咽癌耐药的细胞株CNE2/cDDP,并研究其生物学行为。方法:采用cDDP浓度递增法,经过3个月左右的时间建立了鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/cDDP,倒置显微镜进行形态学观察,MTT检测不同细胞系的耐药性。结果:MTT实验研究发现在不同药物(顺铂、长春新碱、卡铂、紫杉醇、5-FU)作用下,CNE2/cDDP较CNE2的IC50值及耐药指数均有明显的增加,CNE2/cDDP细胞对顺铂的耐药性最强,增加到200.6倍,对5-Fu的耐药性最差,增加到2.8倍;耐药细胞株CNE2/cDDP较非耐药细胞株CNE2生长速度减慢,其细胞倍增时间由18小时增加到24小时;CNE2/cDDP细胞体积较CNE2为小,常呈克隆聚集现象。结论:CNE2/cDDP不光对顺铂具有耐药性,对其他化疗药物也具有不同的耐药性,即具有MDR,并且该细胞系性状稳定,可稳定地传代和保存,是一个理想的用于鼻咽癌的多药耐药研究的细胞系,为下一步蛋白质组学研究提供了基础。
　　第二章鼻咽癌顺铂耐药细胞系的耐药蛋白质组学研究及耐药关键蛋白功能研究
　　目的:本研究通过蛋白质组学方法分离鉴定鼻咽癌耐药细胞系的差异表达蛋白,并对其中的关键蛋白keratin1进行功能研究,以揭示keratin1在鼻咽癌耐药中的作用。方法:采用2-DE+MALDI-TOF-MS进行鉴定,获得了鼻咽癌顺铂耐药的差异表达谱;并对其中的三个关键耐药蛋白(KRT1,CTSD,ANXA5)表达水平进行western blot验证;通过siRNA干扰KRT1表达后,观察KRT1与鼻咽癌耐药性的关系。结果:蛋白质组学方法获得了鼻咽癌细胞株CNE2与其顺铂耐药细胞株CNE2/cDDP的差异蛋白表达谱,并鉴定了其中的17个差异表达蛋白,包括:角蛋白1,角蛋白18,膜联蛋白A5,组织蛋白酶D,cDNAFLJ52723,ME2(转移抑制蛋白),3,2-反式-烯酰辅酶A异构酶,组蛋白2B,热休克蛋白β-1,3-羟氨基-辅酶a脱氢酶-2,丙酮酸硫转移酶,谷氨酸脱氢酶1,内质网转运ATPase,α-烯醇酶,热休克蛋白90α,NADH脱氢酶,核内核糖体蛋白C1/C2等。这些蛋白功能涉及到:细胞骨架,基因组稳定,分子伴侣,代谢相关酶,转运相关信号通路,蛋白合成和转移相关信号通路等。其中三个蛋白KRT1,CTSD,ANXA5在耐药细胞株中CNE2/cDDP中的表达水平均明显上调,与蛋白质组学鉴定的结果是一致的,说明蛋白质组学方法鉴定获得的差异蛋白表达谱是可靠的;keratin1在CNE2/cDDP中表达高于CNE2,siRNA下调keratin1表达后,可以显著性减少鼻咽癌细胞株对五种化疗药物的IC50值,增加鼻咽癌细胞对化疗药物的敏感性;当siRNA下调keratin1表达后,多药耐药蛋白(MRP)的表达也下调,说明keratin1表达与MRP表达具有相关性;keratin1表达下调引起鼻咽癌细胞中MRP表达下调,从而引起鼻咽癌细胞的耐药性降低。结论:1.2-DE结合质谱获得了鼻咽癌顺铂耐药的差异蛋白表达谱;2.获得了17个与鼻咽癌顺铂耐药有关的差异表达蛋白,这些蛋白功能涉及到细胞骨架、基因组稳定、分子伴侣、代谢相关酶、转运相关信号通路、蛋白合成和转移相关信号通路等;3.KRT1,CTSD,ANXA5经验证与鼻咽癌顺铂耐药有关;4.KRT1表达下调可导致鼻咽癌细胞株对顺铂、长春新碱、卡铂、紫杉醇、5-FU的耐药性减低;降低KRT1可导致化疗药物的耐药性降低;5.鼻咽癌顺铂耐药的分子机制可能与KRT1通过下调MRP表达有关。