靶向肿瘤细胞凋亡的新型丹磺酰分子影像探针研究

摘要

细胞凋亡是一种在特定时空主动发生的、受基因严密调控的细胞逐渐死亡现象。肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，从细胞凋亡角度来理解肿瘤的发生机制，是由于细胞凋亡受阻，造成细胞的失控性增殖，产生高度恶化状态的肿瘤细胞。根据细胞凋亡角度和机制选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，已成为目前治疗恶性肿瘤的重要策略。
　　分子影像技术可实现在细胞、基因和分子水平上的生物体内部生理或病理过程的无创实时动态成像，从而为疾病病程的在体监测、基因治疗的在体示踪、药物在体疗效评测、功能分子的在体活动规律研究提供了新的技术平台。
　　分子影像学技术的发展，为在体检测细胞凋亡的研究开创了一条全新的监测途径。高灵敏度、高选择性的新型分子探针的出现，拓宽了人们在细胞凋亡的检测方法上的思路，为更清晰和深入地了解细胞凋亡与疾病发生和发展的关系提供了良好的平台。分子探针是将医学影像学设备与疾病特征性分子联系起来的一类分子，是实现分子影像技术的关键因素和物质基础。在体凋亡分子影像的发展具有重要的临床价值和意义，可帮助加速疾病的早期诊断、监测疾病的发展进程、评估疾病治疗的疗效，还有助于发展新的治疗策略。
　　在前期的研究实验中，我们构建了一类含丹磺酰基团的系列衍生物的有机小分子探针库，设计合成的该新型分子探针是在基于丹磺酰基团的结构修饰或改造，研究表明这些分子探针具有良好的荧光特性，能选择性和特异性的识别和监测乳腺癌细胞MCF-7凋亡。我们运用化疗药物处理建立了肿瘤细胞凋亡模型，通过流式细胞分析仪筛选出合成新型的分子探针Dansyl-8具有靶向凋亡细胞的生物学特性。通过不同的凋亡诱导剂作用，证实分子探针Dansyl-8在检测凋亡的肿瘤细胞反应可有效检测死亡受体通路、线粒体通路以及内质网应激通路的凋亡;在CNEI、MCF-7、A375、EC109四株肿瘤细胞中验证了分子探针的有效性，结果提示该分子探针可有效检测多种肿瘤细胞模型凋亡的发生。
　　通过激光共聚焦显微镜技术探讨分子探针Dansyl-8在凋亡细胞中的亚细胞定位，为进一步研究分子探针Dansyl-8标记凋亡细胞的作用机制提供实验证据。以Annexin V这一细胞凋亡检测的金标准为阳性对照，通过流式细胞分选紫杉醇诱导后Annexin V-FITC标记阳性和阴性细胞，分别运用分子探针Dansyl-8标记，流式细胞术比较两组细胞之间的阳性率差异。在CNE1细胞中的研究我们发现分子探针Dansyl-8的摄入量的改变可直观反映细胞凋亡率的改变。
　　分子探针Dansyl-8是小分子荧光探针，通过改变细胞膜的通透性，探讨了细胞膜通透性提高对分子Dansyl-8在凋亡细胞中积聚的影响。确定细胞摄入分子探针不会随着细胞膜通透性提高而增加，结合之前的研究发现，在凋亡诱导剂的作用下，Dansyl-8的细胞标记率有显著的增高，进一步说明分子探针Dansyl-8具有标记凋亡细胞的特异性和专一性。
　　在活体实验研究中，由于分子探检测光谱的限制，目前的研究只在细胞和组织水平中开展分子探针有效性的评价。通过建立DsRed稳定表达细胞系及其移植瘤动物模型，在组织切片实验中，我们发现注射紫杉醇的移植瘤的分子探针Dansyl-8摄取有显著增加，与TUNEL检测的阳性信号位置相似，提示在组织学水平分子探针具有靶向凋亡细胞的特性，为下一步开展Dansyl-8为多模态探针的深入研究提供了有力的实验证据。
　　综上，本研究通过以鼻咽癌细胞CNEI为基本实验模型，我们设计并筛选靶向凋亡肿瘤细胞的分子探针，在不同凋亡通路及肿瘤细胞进行的研究中，建立了基于分子影像技术的肿瘤细胞凋亡成像的检测平台。同时，在细胞及组织水平上证明这种靶向凋亡的检测与凋亡通路以及凋亡时相的关系。为Dansyl-8作为新型细胞凋亡分子探针提供了有意义的实验证据。