miR-338-3p靶向调控CyclinD1介导在HBx致肝癌恶性转化中的作用及其机制探讨

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是世界范围内原发性肝细胞癌(HCC)的主要发病原因之一，其中HBV X片段被认为是导致肝细胞恶性转化的主要因素。HBV-DNA，尤其是HBx基因频繁整合于宿主基因组，导致染色体的不稳定性和插入突变的发生，与HCC的发生密切相关。MicroRNA（miRNA）是一类内源性的，长度约22 nt非编码小分子单链RNA。它通过与靶mRNA的3'UTR结合，参与转录后水平调控基因的表达。近来的研究结果证明，miRNA突变和异常表达与各种人体肿瘤发生、发展相关，miRNAs与肿瘤相关性的研究已成为近年来肿瘤研究领域中的一个热点，它被认为是一组新的癌或抑癌基因，具有特异性的肿瘤组织表达谱。研究认为miRNA水平的变化常导致其靶基因的表达异常，从而影响了肿瘤的进程，其表达的模式可作为肿瘤诊断/预后的分子标记。深入研究miRNA在人体肿瘤中的表达状况及其功能，对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义，并将有利于肿瘤的诊断、预后及治疗。但现在很少有文献系统的研究与HBx特异相关的miRNA在HBx导致的HCC发生、发展中的作用。我们前期研究已成功构建了稳定表达HBx的肝细胞株（LO2/HBx），并通过裸鼠成瘤实验证实HBx可引起肝细胞癌变，同时发现转染HBx基因后LO2细胞的增殖能力与非锚定依赖生长能力明显增强，我们分析HBx促LO2细胞恶性转化作用可能与其增强G1期调控相关基因如CyclinD1、CyclinG1、E2F1的表达相关。本研究首先采用Agilent公司生产的miRNA芯片检测转染野生型HBx基因前后LO2细胞miRNA表达谱，并筛选出部分差异表达的miRNA，接着阐述通过改变特异性的miRNA的表达是否调节了细胞增殖，特别是对Cyclin基因的调控是本研究的主要内容。本研究从HBx与miRNA入手，探索它们在HBV相关性肝癌的发生发展中的作用及其机制。为进一步理解受HBx影响的纷繁复杂的信号通路提供一定的帮助，试图探讨HBx致癌变新的发病机制。本研究分为五个部分：
　　第一章：利用芯片技术检测HBx基因对肝细胞miRNA表达谱的影响—下调miR-338-3p的表达。
　　目的：研究HBx基因影响LO2细胞的miRNA表达谱，筛选出与HBx相关的miRNA。
　　方法：以LO2/pcDNA3.0细胞为对照，采用Agilent公司生产的miRNA芯片技术检测转染了HBx基因后LO2细胞miRNA表达谱的变化，并通过Real-time荧光定量PCR(qRT-PCR)验证芯片所得结果，筛选出在LO2/HBx细胞中下调倍数最大的miR-338-3p进行下一步的功能研究。
　　结果：芯片结果显示，与LO2/pcDNA3.0细胞相比，LO2/HBx细胞有4个miRNA表达上调，分别为miR-7、miR-1274a、miR-137、miR-663;有11个miRNA表达下调，分别为miR-338-3p、miR-551b、 miR-24-1*、miR-29c、miR-744、miR-455-3p、miR-324-5p、miR-340、miR-660、miR-193a-3p、miR-590-5p，其中miR-338-3p下调最为明显，与qRT-PCR验证的结果相一致。
　　结论：①HBx能影响LO2细胞的miRNA表达谱，如下调miR-338-3p的表达;②miRNA芯片技术检测结果可靠，可用于筛选组织、细胞间的miRNA表达谱。
　　第二章：miR-338-3p对稳定表达HBx细胞的增殖能力影响。
　　目的：第一部分研究已发现HBx可下调miR-338-3p的表达，本部分研究miR-338-3p在HBx致人肝细胞异常增殖中的作用及其相关机制，试图探讨HBx致癌变新的机制。
　　方法：合成特异的miR-338-3p模拟物(mimics)及抑制剂（inhibitor），以相应的阴性对照(NC)作为对照组，通过脂质体转染miR-338-3p mimics/ inhibitor到LO2/HBx和LO2/pcDNA3.0细胞中，MTT、Edu检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期。
　　结果：流式细胞仪发现，转染miR-338-3p增加细胞内miR-338-3p表达之后，G1期延长，S期缩短，而与之相反的是转染miR-338-3pinhibitor降低细胞内miR-338-3p的表达后，G1期缩短，S期延长;MTT结果显示，miR-338-3p可以明显抑制细胞增殖，抑制率分别为40％±9.41和34％±8.3;而抑制miR-338-3p在LO2/HBx和LO2/pcDNA3.0细胞中的表达，则促进细胞增殖（53％±8.1和38％±7.6）。而Edu结果也表明，miR-338-3p可抑制肝细胞DNA的合成，缩短S期细胞比率。
　　结论：①miR-338-3p可抑制细胞增殖;②miR-338-3p抑制细胞增殖的机制可能是通过延长细胞G1期，抑制肝细胞DNA的合成，缩短S期细胞比率，从而抑制肝细胞的增殖。
　　第三章：miR-338-3p靶向调节CyclinD1的机制研究。
　　目的：根据课题组前期研究及在第二部分所得结果，我们发现miR-338-3p可调节肝细胞增殖，且在LO2/HBx细胞中呈现低表达，与CyclinD1的表达水平成负相关，结合生物信息学分析，发现miR-338-3p可与CyclinD1的3'UTR结合，因此推测CyclinD1极可能为miR-338-3p的目的基因。本部分研究miR-338-3p调节CyclinD1的作用机制。
　　方法：①通过Lipofectamine转染miR-338-3p-mimics/inhibitor到细胞中，Real-time定量PCR、Western Blot检测细胞中CyclinD1mRNA、蛋白表达的改变;②利用PCR方法，扩增CyclinD1-3' UTR序列，同时设计引物突变掉两个miR-338-3p的靶标序列，将其克隆到pmirGLO双荧光素酶报告载体中，构建报告质粒CyclinD1-3'UTR野生型及突变型（分别命名为pCyclinD1-3'UTR-WT、pCyclinD1-3，UTR-Mut);同时为进一步明确具体的调控位点，将上述两个靶标序列分别进行突变，构建报告质粒CyclinD1-3'UTR突变型1和2，分别命名为pCyclinD1-3'UTR-Mutl（突变907-913nt）和pCyclinD1-3'UTR-Mut2（突变2397-2403nt）。将以上报告质粒与miR-338-3p mimics及miR-NC共转染到LO2/HBx细胞中，检测荧光素酶表达的改变。
　　结果：①与阴性对照组比较，模拟miR-338-3p表达后，LO2/HBx和LO2/pcDNA3.0细胞中CyclinD1蛋白表达下调，反之抑制miR-338-3p表达后，细胞中CyclinD1蛋白表达显著上调，而miR-338-3p对细胞CyclinD1 mRNA表达无明显影响。②经PCR扩增、双酶切及测序鉴定pCyclinD1-3'UTR-WT、pCyclinD1-3'UTR-Mut、pCyclinD1-3'UTR-Mut1和pCyclinD1-3'UTR-Mut2重组质粒构建成功。③与miR-NC相比，miR-338-3p与pCyclinD1-3'UTR-WT共转染可使海肾荧光素酶活性下降，荧光素酶相对比值下降;虽miR-338-3p均可调控两个位点，但以对pCyclinD1-3' UTR-Mut1的作用更为显著。
　　结论：①miR-338-3p可负性调控CyclinD1蛋白表达;②成功构建了CyclinD1-3' UTR报告质粒;③miR-338-3p与CyclinD1-3'UTR结合，靶向调控CyclinD1，这种作用以CyclinD1-3'UTR的2397-2403nt位点最为显著。HBx可通过下调miR-338-3p的表达而调控了肝细胞恶性增殖，建立了HBx致癌变新的发病机制。
　　第四章：干扰HBx表达后miR-338-3p及CyclinD1表达的改变。
　　目的：我们的研究发现，在稳定表达HBx基因的LO2细胞中，HBx通过下调miR-338-3p的表达调控CyclinD1，从而促进肝细胞增殖。那么，抑制了HBx表达后miR-338-3p与CyclinD1的表达是否也发生相应的改变？本研究为进一步证实，miR-338-3p与CyclinD1在肝细胞中的表达依赖于HBx基因的改变。
　　方法：设计并化学合成针对HBx的3对siRNA分子序列（HBx-siRNA1、HBx-siRNA2、HBx-siRNA3），同时设阴性对照组（转染siRNA阴性对照）。脂质体法瞬时转染LO2/HBx细胞，通过RT-PCR和Western Blot检测HBx基因在mRNA和蛋白水平的变化以验证HBx-siRNA的抑制效果;Real-time PCR检测细胞中miR-338-3p的表达，Westem Blot检测细胞中CyclinD1表达的变化。
　　结果：3对HBx-siRNAs均能降低HBx mRNA的表达，分别降低52.3±2.3％、45.1±3.4％、70.6±4.3％，与阴性对照组相比，差异有显著性（P均＜0.01）;3对特异性HBx-siRNAs转染LO2/HBx细胞后，与阴性对照组相比，均能抑制HBx蛋白表达，抑制率分别为54.6±1.8％，45.8±2.2％，78±3.5％(P均＜0.01)。转染HBx-siRNA到LO2/HBx细胞后，以U6作为内参，Real-time PCR显示细胞中miR-338-3p表达上调(P=0.013);而Western Blot结果显示CyclinD1的表达水平则显著下降(P＜0.001)。
　　结论：干扰HBx基因表达后LO2/HBx细胞中miR-338-3p表达上调，而CyclinD1表达则下降，进一步验证了miR-338-3p与CyclinD1在细胞中的表达依赖于HBx基因的改变，也证实了miR-338-3p直接受HBx基因的影响，通路HBx/miR-338-3p/CyclinD1参与了HBx介导的HCC肿瘤形成的过程。
　　第五章：肝癌组织中miR-338-3p、 HBx及CyclinD1的表达及相互间关系。
　　目的：体外实验已证实并建立了HBx/miR-338-3p/CyclinD1通路，本部分研究肝癌病人的癌组织与癌旁组织miR-338-3p、HBx及CyclinD1的表达情况，结合临床探讨miR-338-3p在HBx介导细胞增殖方面的作用。
　　方法：收集23例肝癌病人癌组织及癌旁组织，采用qRT-PCR检测23例肝癌病人miR-338-3p的表达，RT-PCR、Western Blot、免疫组化分别检测HBx mRNA、CyclinD1及HBx蛋白表达情况，根据Pearson's相关性分析研究HBx、miR-338-3p及CyclinD1三者的关系;同时行HE染色，评估肝组织的病理学改变。
　　结果：⑴17例癌组织(17/23，74％)及5例相应的癌旁组织可检测到HBx mRNA表达，miR-338-3p的表达与肝癌分化程度相关，且在癌组织中的表达量明显低于癌旁组织，然而这种差异只表现在HBx阳性的癌组织中(p＜0.001);尽管无统计学差异，miR-338-3p在HBx阴性的癌组织中表达略高于癌旁组织(p＞0.05)。⑵肝癌组织中HBx蛋白的总体阳性检出率为19/23(82.6％)，其中5例相应的癌旁组织检测到HBx蛋白弱表达， miR-338-3p与HBx的表达呈负相关，即HBx积分越高者miR-338-3p的mRNA表达越低。⑶与癌旁组织相比，肝癌组织中CyclinD1蛋白表达明显增强，HBx可上调CyclinD1的表达，且CyclinD1与miR-338-3p的表达呈显著负相关，miR-338-3p表达越高者，CyclinD1表达则越低。
　　结论：①miR-338-3p在肝癌组织中表达下调，然而仅在HBx表达阳性的癌组织中下调，而在HBx表达阴性的癌组织中表达略有上调，但无统计学意义。②miR-338-3p与HBx表达呈显著的负相关。③HBx可上调肝癌组织中CyclinD1的表达，且CyclinD1蛋白表达水平与miR-338-3p呈负相关。

目录

声明

摘要

中英文缩略词简表

前言

第一章 利用芯片技术检测HBx基因对肝细胞miRNA表达谱的影响—下调miR-338-3p的表达

1．1 材料与方法

1．1．1 主要材料

1．1．2 主要仪器

1．1．3 实验方法

1．2 结果

1．2．1 用于microRNA芯片检测的RNA质量鉴定

1．2．2 芯片检测结果

1．2．3 用于PCR检测的RNA质量鉴定

1．2．4 miR-338-3p在稳定表达HBx的细胞中低表达

1．3 讨论

结论

第二章 miR-338-3p对稳定表达HBx细胞的增殖能力影响

2．1 材料与方法

2．1．1 主要材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 实验方法

2．2 结果

2．2．1 miR-338-3p-mimics／inhibitor转染效率的检测

2．2．2 miR-338-3p对细胞周期的影响

2．2．3 miR-338-3p对细胞增殖能力的影响

2．3 讨论

结论

第三章 miR-338-3p靶向调节CyclinD1的机制研究

3．1 材料与方法

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要仪器

3．1．3 实验方法

3．2 结果

3．2．1 miR-338-3p对CyclinD1 mRNA的影响

3．2．2 miR-338-3p对CyclinD1蛋白的影响

3．2．3 CyclinD1-3’UTR的扩增

3．2．4 重组质粒的鉴定

3．2．5 报告基因证实CyelinD1为miR-338-3p的靶标

3．2．6 报告基因确认miR-338-3p调控CyclinD1的主要位点

3．3 讨论

结论

第四章 干扰HBx表达后细胞中miR-338-3p与CyclinD1表达的改变

4．1 材料与方法

4．1．1 主要材料

4．1．2 主要仪器

4．1．3 实验方法

4．2 结果

4．2．1 RNAi对LO2／HBx细胞HBx mRNA表达的影响

4．2．2 RNAi对LO2／HBx细胞HBx蛋白表达的影响

4．2．3 干扰HBx基因表达后LO2／HBx细胞miR-338-3p的表达

4．2．4 干扰HBx基因表达后LO2／HBx细胞CyclinD1的表达

4．3 讨论

结论

第五章 肝癌组织中miR-338-3p、HBx及CyclinD1的表达及相互间关系

5．1 材料与方法

5．1．1 实验对象

5．1．2 实验试剂及材料

5．1．3 主要仪器

5．1．4 实验方法

5．2 结果

5．2．1 肝癌组织中miR-338-3p的表达

5．2．2 miR-338-3p与肝癌临床病理特征的相关性

5．2．3 肝癌组织中HBx基因mRNA的表达及其与miR-338-3p的关系

5．2．4 免疫组化检测组织中HBx蛋白表达及其与miR-338-3p的关系

5．2．5 肝癌组织中CyclinD1蛋白表达及其与miR-338-3p的相关性

5．3 讨论

结论

全文总结论

本研究的创新点

参考文献

综述 microRNA的研究进展

致谢

攻读学位期间主要研究成果