基于生物信息技术的慢性疼痛致病基因分析与表达验证

摘要

目的:通过生物信息技术对数据库芯片结果进行筛选，以发现可能与慢性疼痛（神经病理性疼痛）发病相关的新致病基因，并对所过滤的差异基因表达谱进行分析。同时构建大鼠脊神经结扎(SNL)模型，观察大鼠疼痛行为学变化，并检测所获致病基因在损伤及非损伤背根神经节(DRG)的表达情况及在不同神经元中的分布，以验证生物信息学筛选基因的可行性，并探讨所获致病基因对神经病理性疼痛发病的可能影响机制。
　　方法:1、从GEO数据库中搜索并下载与神经病理性疼痛相关的芯片数据，应用BRBArrayTools软件对数据进行标准化、过滤及差异基因比较，通过基因功能挖掘平台挖掘文献，并与已有Meta分析比对筛选出未在SNL模型损伤及非损伤侧DRG中发现的致病基因，同时，应用DAVID6.7数据库对非损伤DRG中的差异基因进行分析，探讨非损伤DRG中可能发生的病理生理变化。
　　2、将65只大鼠随机分为正常组(n=15)、Sham组(n=25)及SNL组(n=25)，SNL组建立大鼠左侧SNL模型，Sham组仅暴露左侧L5脊神经而不结扎，正常组未作处理。术前1天及术后1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天测定各组大鼠左后足机械痛阈变化情况，术后3、7、14、21、28天分批处死，取术侧及健侧L4、L5DRG，采用RT-PCR及Western-Blot技术分别对生物信息学方法所获致病基因的mRNA及蛋白表达变化水平进行检测。
　　3、将36只大鼠随机分为正常组(n=9)、Sham组(n=9)及SNL组(n=18)，SNL组建立大鼠左侧SNL模型，Sham组仅暴露左侧L5脊神经而不结扎，正常组未作处理。术前1天及术后1、3、5、7、9、11、14天测定各组大鼠左后足机械痛阈变化情况，术后3、7、14天分批灌注处死，取术侧L4、L5DRG，采用免疫荧光技术检测生物信息学方法所获致病基因在NF200、IB4和CGRP免疫阳性DRG神经元中的表达变化情况。
　　结果:1、采用生物信息技术共获得123条同时在损伤及非损伤DRG中差异表达的基因，经过进一步文献挖掘发现34条与神经病理性疼痛发病相关，其中20条基因未见报道;NSF在已有Meta分析中被认定为与疼痛发生具有最明显联系，此外，在非损伤DRG中基因差异表达主要导致了离子通道及离子运输、神经元损伤、免疫应答、囊泡转运等方面的变化。
　　2、术前三组大鼠机械痛阈无显著差异(P＞0.05)，术后SNL组与空白组及Sham组相比，机械痛阈显著下降(P＜0.05)，同时术侧后肢抬起、足趾并拢、足底轻度外翻，而健侧及其它两组大鼠无明显变化。
　　3、术后各时间点RT-PCR及Western-Blot结果均显示SNL组大鼠术侧L4、L5DRG内NSF的mRNA及蛋白水平较健侧、正常组及Sham组L4、L5DRG显著下降(P＜0.05)。
　　4、免疫荧光结果显示NSF在正常大鼠三种亚型DGR中分布广泛，NSF阳性神经元主要分布于中小神经元。NSF在SNL大鼠IB4及CGRP免疫阳性神经元中表达下降，同时NSF的表达逐渐由中小神经元转向大中神经元。
　　结论:1、利用生物信息技术能够寻找到与神经病理性疼痛发病相关的致病基因，并能通过分子生物学和组织学试验得到验证，提示其可以作为寻找疾病致病基因的一种有效方法。
　　2、大鼠脊神经结扎后NSF的表达下调可能与神经病理性疼痛的发生发展有关。
　　3、生理状态下NSF可能参与DRG各亚型神经元中无害及有害感觉信息的传递，而脊神经结扎后IB4及CGRP阳性神经元中的NSF表达变化可能在神经病理性疼痛的发生发展中起着更为重要的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一章 神经病理性疼痛致病基因筛选及非损伤神经节基因表达分析

技术路线图一

1．1 材料与方法

1．1．1 基因芯片数据

1．1．2 研究方法

1．2 结果

1．2．1 数据过滤及差异基因筛选

1．2．2 疼痛基因的挖掘与新基因筛选

1．2．4 功能分类

1．3 讨论

1．3．1 生物信息学在疾病研究方面的应用

1．3．2 神经病理性疼痛致病基因筛选结果的分析

1．3．3 非损伤DRG中的差异基因表达及病理生理变化

1．4 结论

第二章 NSF在神经病理性疼痛模型背根神经节的表达研究

技术路线图二

2．1 材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要器材及设备

2．1．3 主要试剂和耗材

2．1．4 主要试剂配制

2．2 方法

2．2．1 实验动物分组

2．2．2 脊神经结扎(SNL)模型的建立

2．2．3 一般行为学观察

2．2．4 机械痛阈测定

2．2．5 DRG取材

2．2．6 RT-PCR检测大鼠DRG中NSF mRNA的表达

2．2．7 Western Blot检测大鼠DRG中NSF蛋白的表达

2．2．8 数据处理与统计学分析

2．3 结果

2．3．1 大鼠一般行为学变化

2．3．2 大鼠机械痛阈变化

2．3．3 NSF mRNA在各组大鼠DRG中的表达水平

2．3．4 NSF蛋白在各组大鼠DRG中的表达水平

2．4 讨论

2．4．1 大鼠SNL模型的建立及相关行为学变化

2．4．2 NSF mRNA及蛋白在SNL大鼠非损伤及损伤DRG中表达变化的意义

2．5 小结

第三章 NSF在慢性疼痛模型不同亚型背根神经节神经元的分布研究

技术路线图三

3．1 材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 主要器材及设备

3．1．3 主要试剂和耗材

3．1．4 主要试剂配制

3．2 方法

3．2．1 实验动物分组

3．2．2 脊神经结扎(SNL)模型的建立

3．2．3 一般行为学观察

3．2．4 机械痛阈测定

3．2．5 DRG取材

3．2．6 免疫荧光检测NSF在不同亚型背根节中的分布及表达变化

3．2．7 数据处理及统计学分析

3．3 结果

3．3．1 大鼠一般行为学变化

3．3．2 大鼠机械痛阈变化

3．3．3 正常生理条件下NSF在L4、L5 DRG不同神经元中的分布

3．3．3 慢性疼痛时NSF在L4、L5 DRG不同神经元中的分布及表达变化

3．4 讨论

3．4．1 NSF在正常大鼠不同亚型DRG神经元分布的意义

3．4．2 NSF在SNL大鼠不同亚型DRG神经元中的变化

3．4．3 NSF在非损伤DRG中不同面积及亚型DRG神经元中的变化

3．5 小结

全文结论

参考文献

综述 囊泡膜融合过程在神经系统中作用机制的研究进展

攻读博士学位期间主要研究成果

致谢