中等嗜热浸矿菌共培养体系的培养条件优化研究

摘要

中等嗜热菌不仅热力学效率比较高，而且可以耐受更高的金属离子浓度和矿浆浓度。也有大量的研究表明，单一菌株浸矿存在一定的局限性，不同代谢类型的微生物混合浸矿可以明显提高浸出率，所以中等嗜热混合菌在工业上具有广阔的应用前景。生物冶金技术在工业应用中需要接种大量的浸矿微生物，获得大量的中等嗜热混合菌是迫切需要解决的技术难题。
　　本研究首先构建一个含有铁氧化代谢和硫氧化代谢、自养菌和兼性自养菌、细菌和古菌的中等嗜热浸矿菌共培养体系，包括Sulfobacillus sp.TPY、 Leptospirillum ferriphilum YSK、Acidithiobacilluscaldus S2和Ferroplasma thermophilum L1四株菌。本研究考察了初始pH值、温度、FeSO4·7H2O添加量、硫粉添加量和酵母粉添加量等五个因素对中等嗜热浸矿菌共培养体系的菌体浓度和群落结构的影响，采用响应面分析法进一步优化该共培养体系的培养条件探究了影响共培养体系微生物生长的显著性因素及不同因素之间的交互作用。初始pH值对中等嗜热浸矿菌共培养体系的生长具有明显的影响，初始pH为1.5时菌体浓度在第22小时已达到了最大值4.8×108个/mL，该条件下Sulfobacillus sp.TPY一直是体系中的优势种群。FeSO4·7H2O添加量为40 g/L时，共培养体系的最大菌体浓度可以达到5.21×108个/mL，硫养菌Acidithiobacilluscaldus S2也占有20.18％。硫粉添加量为8g/L和10g/L的情况相差不大，但更加节省能源物质。温度过高或过低都不利于共培养体系微生物的生长，温度为45℃的实验组的菌体浓度的最大值为5.80×108个/mL。酵母粉添加量选择0.02％更为合理，此条件的菌体浓度在第58小时可以达到5.68×108个/mL，Acidithiobacilluscaldus S2的所占的比例为17.55％，Sulfobacillus sp.TPY占44.68％，而Leptospirillumferriphilum YSK占36.9％。Plackett-Burman实验结果表明初始pH值、温度和MgSO4·7H2O添加量三个因素对中等嗜热菌共培养体系的微生物生长的影响最显著。通过最陡爬坡实验和中心组合实验得到这三个最显著因素的最优值为:初始pH值1.38，温度44℃，MgSO4·7H2O添加量0.552 g/L。在最优的条件下进行验证实验，在第58小时所获得的微生物浓度为7.55×108个/mL，且体系中的微生物群落结构情况为:Sulfobacillus sp.TPY(22.33％)，Leptospirillum ferriphilum YSK(37.53％),Acidithiobacilluscaldus S2(36.8％),Ferroplasma thermophilum L1(3.34％)。初始pH值和温度两个重要因素对中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长的交互影响显著，在一定范围的初始pH值(1.38-1.52)内，初始pH值越大，微生物生长的最优温度越低;且随着初始pH值的增大，温度对中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长影响越来越大。初始pH值和MgSO4·7H2O添加量这两个重要因素之间只有略微的交互作用，而温度和MgSO4·7H2O添加量两个重要因素交互作用则不显著。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 生物冶金技术及其应用

1．2 浸矿微生物

1．2．1 中温菌

1．2．2 极端嗜热菌

1．2．3 中等嗜热菌

1．3 微生物间的相互作用与混合菌浸矿

1．3．1 微生物间的相互作用

1．3．2 混合菌浸矿

1．4 微生物群落多样性分析的分子生物学方法

1．4．1 核酸杂交技术

1．4．2 基因序列系统发育分析方法

1．4．3 实时荧光定量PCR分析法

1．5 本文的研究目的与研究内容

1．5．1 本文的研究目的和意义

1．5．2 本文的研究内容

1．6 本论文课题资助情况

2 实验材料与研究方法

2．1 共培养体系的组成

2．2．考察初始pH值对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

2．3 考察FeSO4·7H2O添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

2．4 考察硫粉添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

2．5 考察温度对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

2．6 考察酵母粉添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

2．7 响应面分析法

2．7．1 影响中等嗜热混合菌共培养体系细菌生长的显著因素筛选

2．7．2 最陡爬坡实验设计

2．7．3 中心组合实验设计

2．8 实时荧光定量PCR

2．8．1 中等嗜热浸矿微生物共培养体系微生物总基因组的提取和纯化

2．8．2 PCR特异性引物的设计及检测

2．8．3 实时定量PCR分析中等嗜热浸矿微生物共培养体系的群落结构

2．9 物理化学分析方法

3 中等嗜热浸矿菌共培养体系的培养条件的初步优化

3．1 初始pH值对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

3．2 FeSO4·7H2O添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

3．3 硫粉添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

3．4 温度对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

3．5 酵母粉添加量对中等嗜热浸矿菌共培养体系的影响

3．6 实时定量PCR结果

3．6．1 引物的特异性检测

3．6．2 实时定量PCR的溶解曲线和标准曲线

3．7 本章小结

4 响应面分析法优化共培养体系的培养条件

4．1 影响中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长的显著因素

4．2 最陡爬坡实验

4．3 中心组合实验

4．3．1 中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长菌体浓度的二次多项式方程模型的建立

4．3．2 构建的模型的适合性检验

4．3．3 构建的模型的可信度分析

4．4 优化后的培养条件验证实验

4．4．1 优化后的培养条件下中等嗜热混合菌共培养体系微生物生长情况

4．4．2 优化后的培养条件下中等嗜热混合菌共培养体系微生物的群落结构分析

4．5 本章小结

5 显著性影响共培养体系的因素之间的交互性作用研究

5．1 初始pH值和温度对中等嗜热菌共培养体系微生物生长的交互影响

5．2 初始pH值和MgSO4·7H2O对中等嗜热菌共培养体系微生物生长的交互影响

5．3 温度和MgSO4·7H2O对中等嗜热菌共培养体系微生物生长的交互影响

5．4 本章小结

6 结论

参考文献

攻读学位期间主要的研究成果目录

致谢