鼻咽癌紫杉醇耐药中FOLR1相互作用蛋白的筛选及机制的初步探索

摘要

叶酸受体α(FOLR1)是细胞摄取叶酸的高亲和性受体，课题组前期研究发现FOLR1的表达与鼻咽癌的发生及紫杉醇耐药表型密切相关，而FOLR1引起的鼻咽癌紫杉醇耐药表型似乎与其具有叶酸转运的功能无关。本文将以鼻咽癌亲本细胞系和紫杉醇耐药细胞系为研究对象，从蛋白质之间的相互作用为切入点，探索FOLR1的作用通路与鼻咽癌紫杉醇耐药之间的相关性。首先以FOLR1多克隆抗体为诱饵通过免疫共沉淀技术筛选其相互作用蛋白，初步确定了在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1的相互作用蛋白——角蛋白17(Cytokeratin17，CK17)，接着用免疫共沉淀、Western Blot、免疫荧光共定位等技术鉴定相互作用蛋白质，确定在鼻咽癌亲本细胞和紫杉醇耐药细胞中FOLR1与CK17存在功能上的蛋白质间相互作用。通过生物信息学网络分析相互作用蛋白的作用机制，分析FOLR1可能的作用通路，发现二者之间有一个共同的相互作用蛋白——泛素C(ubiquitin C，UBC)，二者的相互作用蛋白涉及细胞分化、细胞周期、DNA修饰、信号转导等功能。然后再通过siRNA干扰技术沉默FOLR1或CK17，检测作用通路分子的活化情况，发现沉默FOLR1基因，CK17在转录与蛋白水平表达均下调，而沉默CK17基因，FOLR1的表达无变化，分析FOLR1引起的鼻咽癌紫杉醇耐药表型可能通过FOLR1与CK17间的相互作用这条作用通路，而二者间的相互作用可能通过UBC起作用。我们推断鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中FOLR1表达的增高，可能是通过蛋白质的相互作用，诱导和调节与肿瘤细胞生长或凋亡相关的信号分子而发挥作用。

目录

论文说明

声明

摘要

符号说明

前言

1 FOLR1的相互作用蛋白筛选

1．1 引言

1．2 材料

1．2．1 细胞株

1．2．2 主要实验试剂与耗材

1．2．3 主要仪器

1．2．4 主要溶液的配置

1．3 方法

1．3．1 细胞培养

1．3．2 免疫共沉淀方法筛选FOLR1在鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中的相互作用蛋白

1．3．3 质谱分析

1．4 结果

1．4．1 免疫共沉淀筛选出可能与FOLR1相互作用的蛋白

1．4．2 差异蛋白的质谱分析结果

1．4．3 质谱结果

1．5 讨论

1．6 结论

2 验证FOLR1与CK17存在相互作用

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 细胞株

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要仪器设备

2．2．4 主要溶液的配置

2．3 方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 免疫共沉淀及Western Blot方法验证FOLR1与CK17在鼻咽癌亲本细胞及鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中的存在相互作用

2．3．3 免疫荧光双标法分析FOLR1与CK17的共定位关系

2．3．4 生物信息网络分析FOLR1与CK17的相互作用蛋白

2．4 结果

2．4．1 应用FOLR1抗体免疫共沉淀后的复合物中CK17的表达

2．4．2 应用Cytokeratin 17抗体免疫共沉淀后的复合物中FOLR1的表达

2．4．3 免疫荧光双标法分析FOLR1与CK17的共定位关系

2．4．4 生物信息网络分析FOLR1与CK17的相互作用蛋白

2．5 讨论

2．6 结论

3 FOLR1的相互作用蛋白CK17的功能研究

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 细胞株

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要仪器设备

3．3 方法

3．3．1 细胞培养

3．3．2 鼻咽癌细胞及鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中CK17的表达差异

3．3．3 siRNA干扰CNE-1细胞的CK17表达，观察FOLR1的变化

3．3．4 siRNA干扰CNE-1／13细胞的FOLR1表达，观察CK17的变化

3．3．5 CNE-1／13细胞FOLR1 siRNA干扰后Affymetrix表达谱芯片实验

3．4 结果

3．4．1 Cytokeratin 17在鼻咽癌细胞及紫杉醇耐药细胞中的mRNA表达水平

3．4．2 Cytokeratin 17在鼻咽癌细胞及鼻咽癌紫杉醇耐药细胞中蛋白质表达水平

3．4．3 CK17 siRNA干扰效率

3．4．4 鼻咽癌细胞CK17 siRNA干扰后FOLR1的变化

3．4．5 鼻咽癌紫杉醇耐药细胞FOLR1 siRNA干扰后FOLR1、CK17的变化

3．4．6 鼻咽癌紫杉醇耐药细胞FOLR1 siRNA干扰后Affymetrix表达谱芯片结果

3．5 讨论

3．6 结论

总结

参考文献

综述 细胞角蛋白在癌症中的作用

在读期间发表论文及获奖情况

致谢