DDAH2基因修饰EPC加速裸大鼠球囊损伤后再内皮化进程的研究

摘要

研究背景:冠心病患者内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)功能降低是影响支架植入后内皮修复和导致再狭窄的重要原因。近期发现冠心病患者内源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制物非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)增高与EPCs功能降低密切相关，二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)是体内代谢ADMA的关键酶，它在与动脉粥样硬化有关的疾病中功能降低而导致ADMA增高，两者的消长密切影响心血管系统的功能状态。本项目拟构建DDAH2基因过表达的EPCs，观察DDAH2基因过表达对EPCs功能的影响。并在球囊损伤的裸大鼠模型上，进一步观察移植DDAH2基因过表达的hEPCs对血管的再内皮化及内膜增生的影响。探讨DDAH/ADMA系统与EPCs功能改变之间的关系。本研究将有助于揭示EPCs功能损伤的机制，并为再狭窄的防治提供新的思路。
　　方法:实验分为三个部分:
　　(1) EPCs分离与鉴定:采用密度梯度离心法分离人脐血的单个核细胞，培养至第10天，采用乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)与荆豆凝集素1(FITC-UEA-1)双染鉴定，以及流式细胞仪检测分子标志CD133，CD34和vWF以进一步鉴定是否为EPCs。
　　(2) DDAH2基因过表达对EPCs功能的影响:其中DDAH基因过表达慢病毒载体构建由上海吉凯基因化学技术有限公司协助完成;采用荧光法以及RT-PCR法检测转染效率。采用细胞计数法，检测EPCs对人纤维粘接蛋白以及内皮细胞的黏附功能。采用改良的Boyden小室，检测EPCs的迁移能力。
　　(3) DDAH2基因过表达EPCs对裸大鼠球囊损伤后再内皮化进程以及内膜增生的影响。采用伊文思兰染色检测再内皮化;采用HE染色检测内膜增生。
　　结果:
　　(1) DDAH2过表达EPCs对人纤维连接蛋白(FN)的黏附能力显著增强，与对照组比较，P＜0.01，而转染非目的基因的EPCs(NonT-EPCs)对人纤维连接蛋白的黏附作用无明显增强;DDAH2过表达EPCs显著增加TNF-α诱导的EPCs-内皮细胞黏附，与对照组比较，P＜0.01，而转染非目的基因的EPCs(Non T-EPCs)无类似作用。
　　(2)过表达DDAH2显著增强了SDF-1诱导的EPCs迁移能力，与对照组比较，P＜0.01，而转染非目的基因的EPCs(Non T-EPCs)无类似作用。
　　(3)在球囊损伤后移植DDAH2过表达的EPCs显著增加再内皮化率，与对照组（局部注射PBS液）相比，P＜0.01。
　　(4)移植过表达DDAH2的EPCs后，可显著抑制裸大鼠颈动脉球囊损伤后的内膜增生，对照组（局部注射PBS液）相比，P＜0.01。
　　结论:(1)首次证实DDAH2过表达的EPCs黏附和迁移能力显著增强;(2)成功构建裸大鼠球囊损伤模型，并首次发现移植DDAH2过表达的EPCs后，可显著抑制裸大鼠颈动脉球囊损伤后的内膜增生，并加速球囊损伤后的再内皮化进程。