骨髓间充质干细胞核糖体DNA区非病毒基因打靶平台的建立

摘要

背景:干细胞基因治疗有望为许多重大疾病治疗方法的发展带来突破。基因转移载体和靶细胞是基因治疗的两个关键因素。本室开发了一种全新的非病毒基因打靶载体——核糖体DNA区打靶载体，该载体避开了病毒载体的强免疫原性及普通载体的随机插入突变所带来的安全性问题，且能携带外源治疗基因定点高效地靶入到人核糖体DNA区并持续稳定表达。间充质干细胞的多向分化潜能、低免疫原性及靶向受损组织归巢等特点决定了它是一种理想的基因治疗细胞载体，本研究旨在建立利用人核糖体DNA区打靶载体定点修饰人MSCs的技术平台，为利用核糖体DNA打靶载体进行基因治疗奠定基础。
　　方法:血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、维生素C(Vc)、和胰岛素-转铁蛋白-硒-X(ITS-X)被添加到MSC培养基中。MSCs的增殖和存活能力通过MTT、细胞计数、集落形成效率等方法来测定。同时，我们构建了靶向rDNA ITS1的新核糖体DNA打靶载体pHr2-NL并核转到MSCs中，利用G418筛选MSCs抗性克隆，PCR、Southern blot鉴定定点整合克隆，并移植到SCID鼠体内。同时，我们构建了针对rDNA+6523位点的两组锌指酶，与带有无启动子的GFP的核糖体DNA打靶载体共转染，通过流式细胞术检测GFP的表达效率，判断锌指酶对于基因打靶效率的促进作用。
　　结果:bFGF对MSCs的增殖起关键的作用，它能与Vc、VEGF以及ITS-X等因子协同作用刺激MSCs增殖。四种生长因子添加到MSCs培养基中显著地改善了MSCs的克隆形成能力，体外扩增能力，同时保持了干细胞特性。在此基础上，人核糖体DNA打靶载体成功介导新霉素抗性基因靶入到人核糖体DNA区。定点整合的MSCs保持了MSCs的多向分化潜能，典型的MSCs表面标志物，正常核型，且在体内没有致瘤性。体外筛选获得一对有效的锌指酶ZFN-S3，并能提升GFP的表达效率7.5倍。
　　结论:生长因子组合可以在保持MSCs多潜能性的同时协同刺激MSCs增殖，并促进MSCs核糖体DNA区的非病毒打靶;利用核糖体DNA打靶载体成功打靶了MSCs，这是利用非病毒途径进行MSCs基因打靶的首次报道;建立了核糖体DNA打靶载体介导的MSCs基因打靶平台，为核糖体DNA打靶载体的基因治疗奠定了基础;证实锌指酶可用于提高核糖体基因区的打靶效率。

目录

声明

摘要

1 绪论

2 靶向核糖体ITS1区域的打靶载体的构建

前言

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

3 骨髓间充质干细胞增殖能力的提高

前言

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

4 核糖体高效打靶系统应用于打靶MSC

前言

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

参考文献

综述 MSCs的基因修饰及基因治疗研究进展

攻读博士学位期间主要研究成果

致谢