二茂铁—多肽的合成及其对β-淀粉样蛋白聚集的抑制作用

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种发病率几乎与年龄成对数关系的神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)，主要病因是病人大脑中β-淀粉样肽(amyloidβ-peptide，Aβ)的异常聚集而形成细胞外老年斑(senile plaque，SP)沉淀，因此抑制Aβ的异常聚集能有效的延缓或治疗阿尔茨海默氏病。大量研究结果表明Aβ的疏水区五肽Lys-Leu-Val-Phe-Phe(KLVFF)能与Aβ结合，从而阻止Aβ的聚集。利用上述认识，近年来，因Tjernberg五肽(KLVFF)和Soto五肽(LPFFD)能有效抑制Aβ淀粉样沉积，逐渐成为Aβ聚集抑制剂和阻断肽的研究热点。但它们都存在在血浆中稳定性较差、易被酶解以及穿过血脑屏障的能力有限等问题。针对这些问题，本文设计并采用液相或固相合成方法合成了系列二茂铁-多肽化合物。
　　(1)以二茂铁(Fc)、L-赖氨酸(K)、L-亮氨酸(L)、L-缬氨酸(V)和L-苯丙氨酸(F)为原料，采用液相多肽合成法，以苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)及1-羟基苯并三唑(HOBt)为缩合剂，使用逐步缩合与片段缩合相结合的方法合成了具有阻断作用的二茂铁-多肽分子Fc-KLVFF和疏水性多肽Boc-KLVFF，并采用核磁、红外、紫外、质谱对其进行表征。循环伏安扫描结果表明，Fc-KLVFF在0.4～0.8V范围内出现了一对可逆的氧化还原峰，氧化峰(Epa）和还原峰(Epc）电位分别为0.626和0.544 V，峰电位之差△Ep=82 mV，峰电流密度之比Ipa/Ipc=1.08。用RP-HPLC对合成的目标产物的酶解稳定性和亲脂性进行了评价，酶解实验结果表明含二茂铁基团的Fc-KLVFF比不含二茂铁基团的Boc-KLVFF在体外具有更强的抗酶解能力;通过亲脂性评价研究发现两者都具有很强的疏水性，都不易溶于水溶液，特别是经过二茂铁修饰后的Fc-KLVFF的疏水性比KLVFF更强，而亲水性则更差，在水中的溶解度太小，不能直接应用于水溶液。
　　利用二茂铁的电化学活性研究了Fc-KLVFF与Aβ42在混合溶剂中的相互作用，结果表明可以利用电化学方法快速、简便有效的测定Aβ42与Fc-KLVFF之间存在的相互作用。同时采用原子力显微镜(AFM)、透射电镜(TEM)和ThT荧光光谱法研究了合成的上述多肽抑制剂与Aβ42的相互作用情况;结果表明两者都能够与Aβ42相互作用并阻止Aβ42的纤维化聚集;但Fc-KLVFF抑制效果要优于Boc-KLVFF;这归于二茂铁基团具有更强的疏水性使它更容易插入到Aβ的β-片层之间，其空间位阻作用能阻止β-片层的叠加，从而有效的阻止Aβ42纤维的形成。
　　(2)采用Fmoc固相合成法合成了水溶性较好的阻断肽Ac-LPFFD和二茂铁标记的Fc-KLVFFK6，Fc-KLVFFK6含有能与Aβ识别并阻断Aβ形成纤维的疏水性片段，用核磁、红外、紫外、质谱等对其进行表征。在近生理条件下，通过ThT荧光光谱和原子力显微镜(AFM)等手段研究了Ac-LPFFD和Fc-KLVFFK6抑制Aβ42纤维的聚集，结果表明Fc-KLVFFK6能较好的抑制Aβ42纤维化聚集。
　　(3)利用透射电镜和光谱等方法对Fc-KLVFF在甲醇溶液中的自组装行为进行了研究。通过透射电镜观察到Fc-KLVFF在甲醇溶液中自组装成的纳米管，并利用红外、紫外-可见、荧光光谱和圆二色光谱对该纳米管的二级结构进行了研究，光谱研究结果表明Fc-KLVFF通过分子间芳香残基之间的π-π堆积作用和氨基酸之间氢键的共同作用形成具有α-螺旋和β-折叠二级结构的二茂铁-多肽纳米管，最后提出了Fc-KLVFF的自组装机理模型。

目录

声明

摘要

论文中主要缩写词说明

第一章 前言

1．1 阿尔茨海默病和β-淀粉样蛋白

1．1．1 阿尔茨海默病的研究进展

1．1．2 Aβ的产生和功能

1．1．3 针对Aβ的治疗方法

1．2 多肽

1．2．1 生物活性多肽的合成方法

1．2．2 生物活性多肽在医药方面的应用

1．2．3 多肽自组装研究进展

1．3 二茂铁衍生物及其性质

1．3．1 二茂铁及其衍生物在电化学方面的应用

1．3．2 二茂铁及其衍生物在医学领域的应用

1．3．3 二茂铁-多肽及其衍生物的研究进展

1．4 Aβ与抑制剂相互作用的研究方法

1．4．1 荧光光谱法

1．4．2 圆二色谱(CD)法

1．4．3 原子力显微镜(AFM)

1．4．4 其他方法

1．5 本文的选题思路及主要研究内容

第二章 Fc-KLVFF和Boc-KLVFF的合成及表征

2．1 引言

2．2 主要仪器设备及试剂

2．2．1 实验所需主要试剂

2．2．1 实验仪器

2．3 实验部分

2．3．1 产物鉴定、提纯与分析的方法

2．3．2 化合物的表征方法

2．3．3 样品配制

2．3．4 电化学方法

2．3．5 目标产物的体外代谢评价

2．3．6 目标产物的亲脂性评价

2．4 目标产物的合成

2．4．1 化合物Fc-OBt(4)的合成

2．4．2 化合物Fc-KLYFF(12)的合成

2．4．3 化合物Boc-KLVFF(14)的合成

2．5 结果与讨论

2．5．1 目标化合物Fc-KLVFF(12)的表征

2．5．2 目标化合物Boc-KLVFF(14)的表征

2．5．3 Fc-KLVFF(12)溶液的电化学行为

2．5．4 目标产物的体外代谢评价

2．5．5 目标产物的亲脂性评价

2．6 小结

第三章 Fc-KLVFF与Boc-KLVFF阻断Aβ42聚集的研究

3．1 引言

3．2 主要试剂及仪器设备

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．3 实验部分

3．3．1 样品配制

3．3．2 电化学方法

3．3．3 ThT荧光光谱测定

3．3．4 原子力显微镜(AFM)测试

3．3．5 透射电镜(TEM)测试

3．4 结果与讨论

3．4．1 荧光光谱研究目标化合物对Aβ42聚集的抑制作用

3．4．2 AFM和TEM研究目标化合物抑制Aβ42的聚集

3．4．3 电化学研究Fc-KLVFF与Aβ42的相互作用

3．4．4 Fc-KLVFF抑制Aβ42聚集的动力学过程

3．5 小结

第四章 Ac-LPFFD和Fc-KLVFFK6的合成及与Aβ42的相互作用

4．1 引言

4．2 主要试剂及仪器设备

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．3 实验方法

4．3．1 样品配制

4．3．2 ThT荧光光谱测定

4．3．3 原子力显微镜(AFM)测试

4．4 目标产物的合成

4．4．1 Ac-LPFFD(19)的合成

4．4．2 Fc-KLVFFK6(26)和KLVFFK6(27)的合成

4．5 结果与讨论

4．5．1 产物鉴定、提纯分析方法

4．5．2 目标化合物Ac-LPFFD(19)的表征

4．5．3 目标化合物Fc-KLVFFK6(26)和KLVFFK6(27)的表征

4．5．4 目标化合物对Aβ42作用的研究

4．6 小结

第五章 Fc-KLVFF的自组装研究

5．1 引言

5．2 主要试剂及仪器设备

5．3 实验方法

5．3．1 透射电镜

5．3．2 傅里叶红外(FT-IR)光谱分析

5．3．3 荧光光谱

5．3．4 圆二色光谱

5．4 结果与讨论

5．4．1 光谱研究Fc-KLVFF的自组装

5．4．2 二茂铁-多肽纳米管的TEM及能谱分析

5．4．3 二茂铁-多肽纳米管的自组装机制的研究

5．5 结论

第六章 论文结论与展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间的主要研究成果

致谢