颞叶癫痫共阿尔茨海默氏病样神经病变实验病理学探讨

摘要

第一部分癫痫CD1小鼠前脑淀粉样斑及tau病变相关蛋白表达
　　实验原理与目的:以往颞叶癫痫人脑病理学检测发现淀粉样斑和神经原纤维缠结等阿尔茨海默病(AD)样病理改变。啮齿类皮罗卡品癫痫模型能重建人颞叶癫痫的大部分病理学、异常脑电脑活动及癫痫行为学改变。本部分实验拟采用CD1小鼠建立皮罗卡品癫痫模型。通过行为学、电生理及经典组织学方法证实小鼠模型的成功建立。在此基础上，观察和确立与淀粉样斑和神经原纤维缠结形成相关的蛋白表达在癫痫小鼠脑内的变化及其程度。
　　材料与方法:采用2月龄成年CD1小鼠，腹腔注射皮罗卡品诱导实验性颞叶癫痫，对照组腹腔注射生理盐水。在不同存活时间点(24-48小时，及7、14、30、60天)进行电生理和/或脑组织学处理。组织学与免疫组织化学染色比较癫痫和对照动物海马和边缘系统区域的细胞构筑、轴突芽生，淀粉样蛋白(Aβ)及其生成酶贝塔分泌酶1(BACE1)、磷酸化tau和其他相关神经元标记物表达和分布。
　　结果:行为学和电生理检测证实皮罗卡品处理CD1小鼠表现复发性痉挛癫痫发作和海马痫性放电。Timm染色和神经肽(NPY)免疫组化证实癫痫小鼠CA3区苔藓纤维末梢芽生。存活7天及以上癫痫动物尼氏染色显示海马CA1和CA3区细胞死亡。在存活7至60天组癫痫小鼠，贝塔分泌酶1(BACE1)上调伴随苔藓纤维及梨状皮质、杏仁核等亚区轴突芽生，以及局部树突标志物MAP2免疫反应缺失。癫痫小鼠未表现细胞外淀粉样蛋白沉着和磷酸化人样tau蛋白过表达。
　　总结与结论:匹罗卡品诱导CD1小鼠产生慢性复发性颞叶癫痫行为学和神经病理学改变。海马和其它颞叶区域出现局部BACE1表达上调，定位于异常芽生轴突末梢。在BACE1上调的同一区域，存在树突成分损伤或丢失。在缺乏人为（病理/态基因）诱导可能产生脑可溶性Aβ高水平的前提下，颞叶癫痫脑内发生过度生成Aβ的神经元调控变化;尽管在成年CD1小鼠，实验性癫痫未引起典型脑淀粉样斑和神经原纤维缠结病变。
　　第二部分转基因3×Tg-AD小鼠AD样神经病理发生与演化
　　实验原理与目的:转基因3×Tg-AD小鼠随年龄发育而出现脑组织细胞外淀粉样斑和神经元内tau蛋白过磷酸化病变。本实验将对课题组繁殖的3×Tg-AD小鼠淀粉样斑和tau病变的年龄和脑区域相关性演化进行评估。此外，尚无研究报道3×Tg-AD小鼠脑内是否存在BACE1表达异常。本实验也旨在明确BACE1与3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑病变的相关性。
　　材料与方法:采用雄性3×Tg-AD及非转基因小鼠，1-26月龄。脑组织行生化和免疫组化分析。各月龄组脑邻片进行B ACE1，Aβ和磷酸化tau(p-tau)染色。特定年龄组脑切片行荧光双标(1)BACE1与Aβ、p-tau，(2) N-端，中段或C-端特异性Aβ抗体交互双标，(3)BACE1与特异神经元标记物。免疫印迹法检测BACE1和其直接产物淀粉样蛋白前体(APP)贝塔位点剪切片段(β-CTF)水平，酶试剂盒检测BACE1酶活性。
　　结果:(1)3×Tg-AD小鼠前脑内12-14月龄开始出现Aβ染色阳性淀粉样斑，始见于海马下托，随年龄扩展至海马与皮质各层，可见致密型斑，但多为弥散型。BACE1阳性失营养性突起的出现和扩展呈现上述相同时空演化过程。(2) AβN-端(3D6，6E10)和中段(4G8，E50)特异抗体显示皮质和海马锥体神经元胞体，2月龄即出现。经强蚁酸切片预处理，还标记肿胀样轴突末梢，4-6月龄开始出现。这些轴突末梢可被BACE1及β-CTF抗体荧光共标记。(3) AβC-端特异抗体仅显示胞外淀粉样蛋白沉着。(4)磷酸化tau蛋白反应产物存在于部分皮质和海马锥体神经元胞体和树突，2月龄即出现，随年龄增加而增强。(5)与非转基因小鼠相比，3×Tg-AD小鼠脑BACE1、β-CTF、BACE1酶活性水平从12-14月龄开始增加，18-22月龄达到统计学意义。
　　总结与结论:3×Tg-AD小鼠脑淀粉样和tau病变表现年龄和区域相关性发生和进展过程，但两者之间无明显相关性。脑淀粉蛋白沉积可表现为致密型和弥散型，两者的发生可能均与先期出现的轴突病变有关。早期轴突病变表现为肿胀和芽生，伴随BACE1和一些Aβ抗体染色阳性染色，后者可能代表APPβ-CTF聚集。BACE1上调在3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑的起始和演化过程中扮演关键作用。
　　第三部分癫痫3×Tg-AD小鼠AD样神经病理发生与变化
　　实验原理与目的:我们在第一部分实验发现脑BACE1上调伴随癫痫CD1小鼠边缘系统病理性轴突芽生。第二部分实验证实BACE1上调定位于早期肿胀轴突末梢和失营养性神经突起，并伴随3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑发生过程。本部分研究从实验病理学角度探讨皮罗卡品癫痫是否提前和促进3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑和tau病变。本实验旨在检测癫痫脑内进行性轴突病变因伴随BACE1上调会脑区域特异性的引起淀粉样斑形成，也可能与tau蛋白过度磷酸化相关。通过这些观察，试图阐述颞叶癫痫表现AD样神经病变的病理发生机制。
　　材料与方法:采用6-8月龄雄性3×Tg-AD小鼠，皮罗卡品腹腔注射诱导急性痉挛性惊厥，对照组腹腔注射生理盐水。录像监控证实皮罗卡品组动物出现发作性、痉挛性惊厥。动物存活至9、11和14月龄(n=4/年龄组)，行脑组织学与免疫组织化学检测，对海马和边缘系统区域的细胞构筑、BACE1、APP、Aβ、p-tau和神经元特异核抗原(NeuN)免疫反应阳性产物进行定性定量分析。
　　结果:(1)与对照组相反，癫痫3×Tg-AD小鼠呈现典型海马苔藓纤维芽生，表现为齿状回分子层内份出现BACE1强染色带。(2)在9和11月龄癫痫小鼠，海马、梨状皮质和杏仁核出现BACE1阳性失营养性神经突起簇、而对照组无或罕见此类结构。在14月龄癫痫小鼠，这些失营养性神经突起簇的数目多于对照组，且分布比对照组广泛。(3)双重标记分析表明BACE1阳性失营养性神经突起为轴突成分，且伴随局灶性细胞外Aβ沉积。(4)定量分析表明癫痫小鼠海马CA1和下托区失营养性神经突起簇和淀粉样斑光密度均高于对照组。(5)与对照组相比，9、11和14月龄癫痫小鼠齿状回分子层、颗粒细胞层和苔藓纤维终末p-tau染色增强，而在CA1区p-tau产物减少。(6)9、11和14月龄癫痫小鼠CA1、CA3区和梨状皮质出现细胞丢失和NeuN免疫反应下降。
　　总结与结论:和对照转基因动物相比，匹罗卡品诱导的慢性癫痫3×Tg-AD小鼠边缘系统部分区域出现更早和更严重的淀粉样斑病变和神经元内磷酸化tau表达。癫痫3×Tg-AD小鼠脑内这两种AD样病变与神经元损伤和死亡存在区域性相关。BACE1过表达是慢性癫痫动物受损伤脑区轴突芽生及失营养性变的内在信号分子变化之一，可能是加快淀粉斑病变关键因素。

目录

声明

摘要

符号说明

1 绪论 阿尔茨海默氏病与颞叶癫痫共病现象

1．1 阿尔茨海默氏病及其病理特征

1．2 颞叶癫痫及其病理特征

1．3 阿尔茨海默氏病与颞叶癫痫临床共病现象

1．4 学位论文研究目标与整体实验方案

第一部分 癫痫CD1小鼠前脑淀粉样斑及tau病变相关蛋白表达

2．1 实验原理与目的

2．2 材料与方法

2．2．1 实验动物

2．2．2 海马齿状回在体及脑片电生理记录

2．2．3 脑组织学处理

2．2．4 改良法Timm染色

2．2．5 免疫组织化学染色

2．2．6 成像，数据分析和统计学检涓

2．3 结果

2．3．1 癫痫CD1小鼠海马痫性电活动

2．3．2 癫痫CD1小鼠海马细胞丢失及Timm染色显示苔藓纤维芽生

2．3．3 癫痫CD1小鼠苔藓纤维BACE1表达变化

2．3．4 癫痫小鼠其他前脑区域BACE1表达变化

2．3．5 癫痫小鼠脑BACE1高表达的神经元成分定位

2．3．6 癫病小鼠脑Aβ及磷酸化人tau蛋白抗体检测

2．4 讨论

2．4．1 BACE1染色可标示癫痫小鼠海马苔藓纤维芽生

2．4．2 BACE1染色可标示癫痫小鼠其它颞叶区域轴突病变

2．4．3 癫痫小鼠颞叶区域BACE1上调的神经生物学和神经病理学意义

2．4．4 癫痫CD1小鼠缺乏明显淀粉样斑和神经原纤维缠结病变

第二部分 转基因3×Tg-AD小鼠AD样神经病理发生与演化

3．1 实验原理与目的

3．2 材料与方法

3．2．1 实验动物

3．2．2 组织学处理

3．2．3 免疫组织化学染色

3．2．4 免疫印迹分析

3．2．5 APPβ位点酶裂解活性测定

3．2．6 成像，数据分析和统计学检验

3．3 结果

3．3．1 3×Tg-AD小鼠前脑突变APP、淀粉样斑及p-tau年龄相关表达概况

3．3．2 老年3×Tg-AD小鼠前脑区域的致密型和弥散型淀粉样斑

3．3．3 3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑的早期发生过程

3．3．4 轴突末梢及失营养性神经突起Aβ抗体标记的交叉验证

3．3．5 3×Tg-AD脑BACE1蛋白质浓度，酶活性及β-CTF水平年龄相关变化

3．3．6 3×Tg-AD小鼠前脑淀粉样病变与p-tau病变相关性比较

3．4 讨论

3．4．1 3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑发生的年龄相关性

3．4．2 3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑的形态学特点

3．4．3 早期异常轴突Aβ抗体免疫反应评介

3．4．4 轴突病变作为致密型和弥散型淀粉样斑形成的共同驱动因素

3．4．5 3×Tg-AD小鼠脑淀粉样斑和p-tau病变缺乏相关性

第三部分 癫痫3×Tg-AD小鼠AD样神经病理发生与变化

4．1 实验原理与目的

4．2 材料与方法

4．2．1 实验动物与癫痫模型制备

4．2．2 脑组织学处理

4．2．3 免疫组织化学染色

4．2．4 成像，数据分析和统计学检验

4．3 结果

4．3．1 癫痫3×Tg-AD小鼠边缘前脑Aβ及其生成相关蛋白表达变化

4．3．2 癫痫3×Tg-AD小鼠边缘前脑磷酸化tau表达变化

4．3．3 癫痫3×Tg-AD小鼠边缘前脑神经元丢失

4．4 讨论

4．4．1 癫痫3×Tg-AD小鼠脑Aβ生成蛋白表达增高与淀粉样斑提前发生

4．4．2 癫痫3×Tg-AD小鼠边缘前脑区域性磷酸化tau表达异常

4．4．3 癫痫3×Tg-AD小鼠边缘前脑区域性神经元死亡

4．4．4 颞叶癫痫脑组织淀粉样斑及tau病变的病理发生机制

学位论文总结与综合结论

参考文献

综述 BACE1抑制干预神经疾病早期轴突病变

攻读学位期间主要学术成果

致谢