解脲支原体感染增强人子宫内膜上皮细胞株HSP70和RBM4表达

摘要

目的:以体外培养的人正常子宫内膜上皮细胞为研究对象，观察UU1对细胞存活率及细胞形态学的影响;从本课题组前期应用蛋白质组学鉴定出的一系列表达变化的蛋白质中，筛选出HSP70(Heatshock protein70)和RBM4(RNA binding protein 4)，进一步定量验证UU1感染后两种蛋白在转录和翻译水平的变化，以期确定是否是致病性UU感染的标志性蛋白。
　　方法:采用体外实验的方法，以人正常子宫内膜上皮细胞作为模型进行研究，首先以不同浓度的UU1干预人正常子宫内膜上皮细胞后光学显微镜下比较干预组与对照组细胞形态学变化，然后通过Hoechst33258染色结合荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化;然后以不同浓度的UU1感染人子宫内膜上皮细胞4h、8h、12h、24h后，同时设立阴性对照组（不添加UU1仅加等量的新鲜UU培养液）和凋零组(不加细胞，只有PBS)，通过MTT实验，检测UU1对人子宫内膜上皮细胞存活率的影响及细胞凋亡情况;选用1×107copy/mlUU1感染人子宫内膜上皮细胞作为进一步研究条件，UU1处理细胞24小时后分别提取干预组和阴性对照组的细胞总蛋白质，进行蛋白质定量，通过Western blot试验定量检测干预组和对照组中HSP70和RBM4蛋白质表达量的变化;并分别提取干预组和对照组细胞中的总RNA，通过real time qPCR检测Hsp70和RBM4 mRNA表达水平变化。
　　结果:1.UU1体外作用于人正常子宫内膜上皮细胞24小时后，光学显微镜下干预组与对照组未见明显的形态学差别;Hoechst33258染色后，发现部分细胞胞核浓染，染色质致密，聚集在核膜周围，遮光性增强，并有凋亡小体形成。
　　2.UU1对人正常子宫内膜上皮细胞的生长有抑制作用，不同浓度的UU1干预细胞后，细胞存活率明显不同，107copy/ml、108copy/ml浓度组在4、8、12、24h各时间点对细胞抑制率的影响与对照组相比均有统计学意义(P＜0.05)，且随着浓度增加和感染时间延长，抑制作用越明显。106copy/ml浓度组在感染24h后对细胞抑制率与对照组相比有统计学意义(p＜0.05)，但是其他时间点对细胞抑制作用不明显，1×105 copy/ml浓度组在各感染时间点对细胞生长的抑制作用均不明显，差异无统计学意义(p＞0.05)。
　　3.Western blot定量结果显示:UU1干预人正常子宫内膜上皮细胞24h后，与对照组相比，Hsp70和RBM4两种蛋白表达量均明显增加，差异有统计学意义(P＜0.001);real time-qPCR结果显示:Hsp70和RBM4两种基因在UU1感染的人子宫内膜上皮细胞表达量较高，在对照组低表达，差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　结论:1.UU1对体外培养的人正常子宫内膜细胞具有生长抑制作用，可以剂量和时间依赖方式诱导细胞凋亡，并引起细胞凋亡的形态学改变。
　　2.HSP70和RBM4在UU1处理组其mRNA和蛋白水平明显升高，提示其可能是UU感染的特异性蛋白。子宫

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料与仪器

2．1．1 细胞来源

2．1．2 主要试剂

2．1．3 仪器设备

2．1．4 各种溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 UU1的液体培养

2．2．2 UU活性的测定及各组UU浓度的配制

2．2．3 人子宫内膜上皮细胞的体外培养

2．2．4 Hoechst33258荧光染色检测凋亡细胞

2．2．5 MTT法检测细胞存活率

2．2．6．western blot分析

2．2．7 荧光实时定量PCR反应(real time-qPCR)

2．3 统计学分析

3 结果

3．1 细胞形态学观察结果

3．1．1 光学显微镜下观察UU1感染对人子宫内膜上皮细胞的形态影响

3．1．2 Hoechst染色检测细胞凋亡结果

3．2 不同浓度UU1对细胞存活率的影响

3．3 Western blot定量检测胞内Hsp70和RBM4表达量改变

3．3．1 WB检测HSP70蛋白结果

3．3．2 WB检测RBM4蛋白结果

3．4 Real time qPCR检测hsp70和RBM4 mRNA结果

3．4．1 Real time qPCR检测HSP70 mRNA结果

3．4．2 Real time qPCR检测RBM4 mRNA结果

3．4．3 Real timeqPCR检测β-actin结果

4．讨论

4．1 UU1的致病性与人子宫内膜上皮细胞凋亡

4．2 HPS70和RBM4在UU1感染人子宫内膜上皮细胞后表达的意义

4．3 本研究存在的不足与展望

5 结论

参考文献

综述 解脲支原体脂质相关膜蛋白与宿主细胞相互作用的研究

攻读学位期间发表文章

致谢