不同能源培养下A.f菌能量代谢基因的表达差异研究

摘要

嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxdians简称A.f菌)广泛应用于矿石浸出，环境修复及煤炭脱硫等领域，是生物浸矿研究的模式菌，A.f菌在浸矿的同时获得能量，驱动固定空气中的二氧化碳及氮气用于生物体的合成实现生长繁殖，进而增强浸矿。A.f菌展现了多样的能量代谢方式以及在严峻环境下顽强的适应能力。大量文献报道A.f菌有灵活的多分支呼吸途径和众多的冗余电子传递组分。本文以不同能源培养条件下A.f菌为研究对象。
　　具体研究内容分为三部分:描述了在亚铁、元素硫培养，硫代硫酸盐培养，元素硫耦合三价铁还原厌氧培养条件下的A.f菌及黄铁矿培养的矿物吸附菌和游离菌的生长状况;利用实时荧光定量PCR技术研究了A.f菌25个能量代谢基因在六种条件下培养菌的转录表达差异;对部分基因进行了生物信息学分析。
　　结果表明，A.f在亚铁、元素硫及黄铁矿为能源的培养基中生长活跃，在硫代硫酸钠为能源培养条件下，菌体形态变长，活动迟缓，而在元素硫耦合三价铁还原厌氧培养条件下，A.f生长及能量代谢趋于停滞状态。基因转录差异结果表明:AFE_1130、CycA2、Cyc1_like、bo3复合体、AFE_2761、AFE_1293及Mrp可能参与硫代谢氧化;而AFE_0652, Cyc2_like，Cyc2、CycA1、Cyc1及Acop则可能参与亚铁氧化代谢;在硫培养菌中，碳氮合成代谢及生物合成更为旺盛;细胞色素aa3及bd复合体可能均参与了铁硫氧化代谢;潜在NADH-醌氧化还原酶及ATP合酶基因均参与硫及亚铁氧化代谢，但在硫培养条件下表达水平更高，有关这四个基因的解释有待进一步研究。生物信息学分析表明:AFE_1130是一个10 KDa左右的单核色素蛋白，属于细胞色素ClassⅠ类ID亚类，由5段螺旋及无规卷曲构成，锚定在菌的内膜上并面向胞质参与硫氧化电子传递;CyoA是一个36 kDa左右的稳定胞质蛋白，由7段螺旋及11段折叠链构成，分为两个结构域即N端跨膜结构域及C端结构域。锚定在胞质内膜，将电子由泛醌传递给终端电子受体O2，发挥泛醌终端氧化酶亚基Ⅱ的功能。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 嗜酸氧化亚铁硫杆菌及其生理代谢

1．1．1 亚铁氧化

1．1．2 硫氧化

1．1．3 二氧化碳固定

1．1．4 氮气固定

1．1．5 无氧呼吸

1．2 黄铁矿及其浸出机理

1．3 荧光定量PCR技术

1．3．1 定量原理

1．3．2 分类及应用

1．3．3 内参基因的选择

1．3．4 数据的处理

1．3．5 注意事项

1．4 生物信息学概述

1．5 本论文的研究目的和研究内容

1．5．1 研究的目的及意义

1．5．2 研究内容

1．5．2 受资助情况

2 实验材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 矿样分析

2．1．2 研究纯菌株的获得及保藏

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 培养基及培养条件

2．1．5 主要溶液配制及生化试剂

2．2 实验方法

2．2．1 菌株的驯化及培养

2．2．2 生长曲线绘制和pH及电位测定

2．2．3 培养基中Fe(Ⅱ)和SO42-及S2O32-浓度测定

2．2．4 不同能源培养菌的收集

2．2．5 基因组提取及浓度测定

2．2．6 内参基因的选择

2．2．7 总RNA的提取及质量评估

2．2．8 cDNA的合成

2．2．9 PCR引物设计

2．2．10 Real-time PCR及标准曲线绘制

2．2．11 生物信息学分析

3 不同能源培养菌的生长情况

前言

3．1 亚铁培养

3．1．1 细胞密度变化曲线

3．1．2 pH及电势变化曲线

3．1．3 铁离子及亚铁氧化率变化曲线

3．2 黄铁矿培养菌生长情况

3．2．1 细胞密度变化曲线

3．2．2 pH变化

3．2．3 亚铁离子和硫酸根离子及浸出率变化

3．3 元素硫培养

3．3．1 细胞密度变化曲线

3．3．2 pH及硫酸根离子浓度变化

3．4 硫代硫酸盐培养

3．4．1 菌体形态变化

3．4．2 细胞密度变化

3．4．3 pH变化

3．4．4 硫代硫酸根及硫酸根离子变化

3．5 氧气缺乏条件下培养

3．5．1 细胞密度变化

3．5．2 pH变化

3．5．3 铁离子的变化

本章小结

4 能量代谢基因转录表达差异

前言

4．1 引物及RNA的质量评估

4．1．1 引物质量评估

4．1．2 总RNA质量评估

4．2 Real-time PCR标准曲线及数据处理方法

4．3 Real-time PCR结果分析

4．3．1 八个细胞色素类蛋白基因

4．3．2 三个终端氧化酶复合体亚基基因

4．3．3 碳氮固定及胞外多聚物合成关键酶基因

4．3．4 四个能量转换相关基因

4．3．5 三个铁氧化相关基因

4．3．6 四个硫氧化相关基因

本章小结

5 两个能量代谢关键基因生物信息学分析

前言

5．1 单核细胞色素c

5．1．1 氨基酸序列分析

5．1．2 二级结构预测

5．1．3 三级结构预测

5．2 终端氧化酶CyoA亚基

5．2．1 氨基酸序列分析

5．2．2 二级结构预测

5．2．3 三级结构预测

本章小结

6 全文结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间主要的研究成果目录

致谢