地尔硫卓对血管紧张素Ⅱ损伤内皮细胞的保护作用及其可能机制研究

摘要

目的:探讨地尔硫卓(Diltiazem，Dil)对血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用及其可能的机制。
　　方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cells，HUVECs)，用10-6M的Ang-Ⅱ作为损伤因子模拟体外损伤模型，以氯沙坦(Losartan，LT)为阳性药物对照，观察Dil对Ang-Ⅱ损伤的HUVECs的保护作用及其保护作用是否与GHSRIa受体有关。细胞分组:(1)正常对照组;(2) Ang-Ⅱ(10-8M、10-7M、10-6M、10-5M)损伤组;(3) Dil(10-8M、10-7M、10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组;(4)[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)+Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组;(5) LT(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组;(6) Dil(10-6M)组;(7)[D-Lys3]-GHRP-6(GHSRIa受体选择性阻断剂，25μM)组。细胞贴壁后，随机分组，加GHSRIa阻断剂[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min，然后分别加入Dil(10-8M、10-7M、10-6M)及LT(10-6M)处理细胞30min，最后再加入Ang-Ⅱ(10-6M)处理细胞24h。MTT检测HUVECs细胞活力;流式细胞术检测HUVECs凋亡率及HUVECs中活性氧水平;比色法检测细胞培养上清液中NO含量和乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)活性;Real time PCR检测HUVECs中eNOS和p47phox mRNA表达;Western blot检测HUVECs中eNOS及p47phox蛋白表达。
　　结果:
　　1.各药物对细胞活力的影响:(1)与对照组相比较，Ang-Ⅱ(10-7M、10-6M、10-5M)呈浓度依赖性及时间依赖性降低细胞活力（P＜0.05）;
　　(2)与损伤组(10-6M)相比较，Dil呈浓度依赖性提高细胞活力(P＜0.05)。
　　2.各药物对细胞凋亡率的影响:(1)与对照组相比较，Ang-Ⅱ呈浓度依赖性增加HUVECs细胞凋亡率(P＜0.05);(2) Dil预处理细胞30min呈浓度依赖性降低细胞凋亡率(P＜0.05);(3)与Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min明显增加细胞凋亡率(P＜0.05)。
　　3.各药物对细胞产生活性氧的影响:(1) Dil预处理组浓度依赖性降低HUVECs中产生的活性氧（P＜0.05）;(2)与Dil(10-6M)+ Ang-Ⅱ组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min，细胞活性氧水平显著升高（P＜0.05）。
　　4.各药物对细胞上清液中NO和LDH释放的影响:(1) Dil预处理组显著增加细胞上清液中NO含量(P＜0.05)，降低LDH活性(P＜0.05);(2)与Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min明显减少细胞上清液中NO含量，增加LDH活性(P＜0.05)。
　　5.各药物对细胞eNOS mRNA及其蛋白表达的影响:(1) Dil预处理组显著上调细胞eNOS mRNA及其蛋白表达水平（P＜0.05）。(2)与Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育组明显下调细胞中eNOS mRNA及其蛋白表达水平(P＜0.05)。
　　6.各药物对细胞p47phox mRNA及其蛋白表达的影响:(1) Dil预处理组下调p47phox mRNA及其蛋白表达水平(P＜0.05);(2)与Dil(10-6M)+Ang-Ⅱ(10-6M)组相比较，[D-Lys3]-GHRP-6(25μM)预孵育细胞30min，显著上调细胞中p47phox mRNA及蛋白表达水平(P＜0.05)。
　　结论:
　　(1) Dil对Ang-Ⅱ损伤的HUVECs具有保护作用，其保护作用可能与Dil抗氧化性和上调eNOS、NO有关;
　　(2) GHSRIa阻断剂预孵育能够减弱Dil的抗氧化性及下调eNOS、NO;
　　(3) Dil保护Ang-Ⅱ诱导损伤的HUVECs作用可能部分由GHSRIa受体介导。

目录

声明

摘要

专业名词缩写中英文对照表

第一章 前言

第二章 实验材料

2．1 主要试剂

2．2 主要仪器

2．3 实验用药

2．4 溶液配制

2．5．实验所用细胞

第三章 实验方法

3．1 细胞培养

3．1．1 细胞复苏

3．1．2 细胞传代

3．1．3 细胞冻存

3．2 实验分组

3．3 建立损伤模型

3．3．1 MTT法检测细胞活力

3．3．2 Annexin V-FITC／PI双荧光染色法检测细胞凋亡率

3．4．指标观察及方法

3．4．1 MTT检测细胞活力

3．4．2 Annexin V-FITC／PI双荧光染色法检测细胞凋亡率

3．4．3 流式细胞仪检测细胞内ROS水平

3．4．4 细胞上清中NO的含量测定

3．4．5 细胞上清中LDH活性检测

3．4．6 RT-PCR检测eNOS、p47phox mRNA表达

3．4．7 Western blotting检测eNOS、p47phox蛋白表达

3．5 数据统计分析

第四章 实验结果

4．1 正常培养HUVECs的形态

4．2 损伤模型的建立

4．2．1 MTT检测不同浓度的Ang-Ⅱ对HUVECs细胞活力的影响

4．2．2 不同浓度的Ang-Ⅱ对HUVECs凋亡率的影响

4．2．3 Ang-Ⅱ作用不同时间对HUVECs细胞活力的影响

4．3 Dil对Ang-Ⅱ损伤HUVECs细胞活力的影响

4．4 不同处理因素对Ang-Ⅱ损伤HUVECs凋亡率的影响

4．5 不同处理因素对Ang-Ⅱ损伤HUVECs产生ROS的影响

4．6 不同处理因素对Ang-Ⅱ损伤HUVECs产生NO的影响

4．7 不同处理因素对Ang-Ⅱ损伤HUVECs产生LDH的影响

4．8 不同处理因素对Ang-Ⅱ损伤HUVECs eNOS mRNA表达水平的影响

4．9 不同处理因素对Ang-Ⅱ损伤HUVECs p47phox mRNA表达水平的影响

4．10 不同处理因素对Ang-Ⅱ损伤HUVECs eNOS及其蛋白表达的影响

4．11 不同处理因素对HUVECs p47phox蛋白表达水平的影响

第五章 讨论

第六章 结论

参考文献

综述 地尔硫卓对血管内皮的作用研究进展

攻读学位期间主要的研究成果

致谢