SD大鼠脑缺血再灌注和丁苯酞干预后Mipu1表达变化的研究

摘要

目的:
　　观察Mipu1在脑缺血再灌注大鼠模型中表达的动态变化及丁苯酞NBP是否能促进Mipu1表达来发挥脑保护作用。
　　方法:
　　将64只清洁级SD雄性大鼠随机分成4组:对照组:不做任何处理直接处死（4只）;假手术组:只在右侧颈总动脉处插入约10mm左右，不完全栓塞大脑中动脉（20只）;脑缺血再灌注组20只，在右侧行大脑中动脉完全栓塞;药物干预组20只，脑缺血再灌注后持续用丁苯酞注射液（80 mg/kg）灌胃，连续7天。各组都随机分为4组，并于6h，1d，3d，7d处死老鼠，取脑组织于-70℃冰冻待用。根据Bederson评分法来评价术前、术后SD大鼠的神经功能缺损程度。分别用HE染色、免疫荧光和电生理监测脑组织的病理变化，WesternBlot法测定Mipu1、Bcl-2、Caspase3蛋白的表达，RT-PCR定量检测mRNA变化。
　　结果:
　　1.Bederson评分:正常对照组和假手术组大鼠均未出现神经系统功能缺损症状，评分为0;缺血再灌注处理后大鼠具有明显的神经功能障碍，评分为2-3;加入丁苯酞干预后，神经功能障碍得到明显缓解，评分为1-2。缺血再灌注组，缺血时间越久的大鼠神经功能缺损的程度越重;加入丁苯酞干预后，药物干预的时间越长则神经功能缺损程度越轻。
　　2.HE染色:正常对照组和假手术组大鼠的脑组织外观正常，海马病理切片上形态结构也无显著变化，均可见到固缩浓染的锥形细胞，并且海马区组织染色均匀。缺血(2h)再灌注后病理变化明显，部分神经细胞缺失，脑组织出现疏松，海马区细胞损伤严重，出现大量空泡。丁苯酞药物干预后脑组织病理损伤程度明显减轻，与非药物干预组比较有统计学意义（P＜0.05）。
　　3.RT-PCR:(1)与正常组相比，脑缺血再灌注组的Mipu1基因mRNA水平表达有差异，Mipu1表达随着灌注时间的延长而增加，6h时达到高峰，持续到24h;而后Mipu1的表达呈下降趋势。模型组与正常组相比较，Mipu1的表达有显著性差异(P＜0.01);(2) Mipu1的表达量在脑缺血再灌注后用丁苯酞干预后升高，与非处理组相比较有显著性差异(P＜0.05)。
　　4.Western Blot:(1)与正常组相比，Mipu1的蛋白表达水平有差异，灌注后表达量增加，6h时达到最高，持续到24h后蛋白表达量慢慢下降，7d时降到最低;(2) Bcl-2蛋白的表达与Mipu1有相同规律，随着Mipu1的表达增加而增加，减少而减少;但是Caspase3的表达却与Mipu1的表达负相关;(3)药物干预后，Mipu1和Bcl-2的蛋白表达量上升，Caspase3下降，与非药物干预组比较有显著性差异（P＜0.05）。
　　结论:
　　1.Mipu1在大鼠脑缺血再灌注后多个时间点的表达上调，其作用机制与细胞凋亡途径相关。
　　2.丁苯酞的干预促进了Mipu1的表达，提示Mipu1可能是丁苯酞的作用靶点。

目录

声明

摘要

英文缩略词索引

前言

技术路线

第一章 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 主要仪器设备

1．1．2 主要试剂与药品

1．1．3 实验动物

1．2 方法

1．2．1 实验动物分组

1．2．2 动物模型制作

1．2．3 标本处理

1．2．4 HE染色

1．2．5 免疫组化步骤

1．2．6 数据采集

1．2．7 组织总RNA提取及RT-PCR步骤

1．2．8 组织总蛋白提取及Western blot

1．3 数据处理及统计学处理

第二章 结果

2．1 模型制作结果

2．2 神经功能缺损程度比较

2．3 病理结果观察

2．4 Mipu1的免疫组化染色结果

2．5 大鼠脑缺血再灌注后脑组织中Mipu1表达的动态变化

2．6 大豆脑缺血再灌注后Bcl-2和Caspase-3的表达变化

2．7 丁苯酞干预后Mipu1、Bcl-2、Caspase-3表达变化

第三章 讨论

3．1 脑缺血再灌注模型的评价

3．2 脑缺血再灌注中的内源性保护机制

3．3 Mipu1的脑细胞保护作用

3．4 丁苯酞治疗脑缺血的分子机制

第四章 结论

参考文献

综述 Mipu1与脑缺血关系的研究进展

致谢